1. DNA replikatsioon * DNA replikatsioonikahvli struktuur Replikatsioonikahvel on Y-kujuline aktiivne struktuur, mis moodustub sünteesilookuse juures, kus 2-ahelaline DNA läheb üle 1-ahelaliseks. See tekib rakutuumas DNA replikatsiooni ajal. Selle loovad helikaasid, mis lõhuvad kahte DNA ahelat koos hoidvaid vesiniksidemeid. Selle tulemusena tekib kaks üksikahelat, mis moodustavadki kahvli harud. Need üheahelalised harud on aluseks juhtiva ja mahajääva ahela tekkele. * Imetaja DNA replikatsiooni kahvel (vt ka seminari materjali) 3` 5`
Lahtikeerdumise eest vastutavad helikaas valgud. Torsioonjõudude leevendamiseks on vaja DNA ahelal katkete tekitamine- seda teevad topoisomeraas valgud. DNA replikatsiooni alguspunkt ja replikon Kaheahelise DNA lahti harutamine toimub replikatsiooni alguspunktist (origin). Tekib replikatsioonisilm, mille mõlemasse otsa moodustub Y-kujuline struktuur, mida nimetatakse replikatsioonikahvliks. Replikon on replitseerunud DNA-segment, mis on lähtunud ühest alguspunktist. DNA replikatsioonikahvel liigub mõlemas suunas. Tekib 2 tütar-DNA molekuli. Eukarüootse raku kromosoomil on palju replikatsiooni alguspunkte ja replikone. Replikatsioonikahvli liikumine DNA süntees alati 5’-˃ 3’ suunaline. See tähendab, et: ühte, see on liiderahelat, saab pikendada jätkuvalt teist, see on viivisahelat saab pikendada RNA primerite ja spetsiaalse ensüümi, praimaasi, abil Sünteesi tagajärjel tekivad viivisahelal lühikesed DNA fragmendid, mida nimetatakse Okazaki
teatud lõikudel. Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR) on kunstlikul sünteesil kasutatav tehnika. See toimub tsükliliselt ning on vajalik kindla märklaud-DNA paljundamiseks. DNA replikatsioon. kaksikheeliks on lahtikeerdunud ning mõlemad ahelad toimivad uute ahelate sünteesil matriitsina Sisukord · 1 DNA struktuur · 2 DNA polümeraas · 3 Replikatsiooni protsess o 3.1 Originid o 3.2 Replikatsioonikahvel o 3.3 Juhtiv ahel o 3.4 Mahajääv ahel o 3.5 Regulatsioon 3.5.1 Eukarüoodid 3.5.2 Bakterid o 3.6 Terminatsioon · 4 Viited DNA struktuur DNA esineb tavaliselt kaheahelalise struktuurina, mille mõlemad otsad on kokku keeratud, et moodustada iseloomulikku kaksikheeliksit. Iga DNA ahel on kokku pandud nelja tüüpi nukleotiididest, mille lämmastikalusteks on adeniin, tsütosiin, guaniin ning tümiin
o Kaksikahelaline DNA dupleks DNA-l kaks nukleotiidiahelat, mis koos nõrkade H-sidemetega Moodustuvad N-aluspaarid Adeniin:Tümiin (2 H-sidet) ja Guaniin:C (tsütosiin) (3 H-sidet) Seetõttu on DNA ahelad komplementaarsed DNA ahelad antiparalleelsed Heeliks ringjas (1. ja 11. kohakuti) o DNA tuumas ca 23 000 geeni DNA replikatsioon o o Replikatsioonikahvel (DNA ahelad lahus) DNA topoisomeraasid (muudavad DNA spiralisatsiooni) DNA helikaasid (teevad ahelad lahti) SSB valgud (kaitsevad üksikahelalist DNA-d) o Ahelate eristamine Liiderahel (pidev süntees DNA püolümeraas III- abil) Mahajääv ahel (moodustub praimosoom, süntees fragmentidena) Okazaki fragmendid o RNA praimer (sünteesitakse RNA polümeraasiga)
Mittekromatiinne tuumamaterjal 2. DNA replikatsioon Duplikatsiooniprotsess, mis leiab aset matriitsilt kopeerimise tulemusel. Näiteks DNA de novo süntees. Replikatsiooni etapid: ensüüm helikaas lõhub DNA biheeliksi, ensüüm DNA-polümeraas seondub DNA ahelaga, DNA-polümeraas sünteesib mõlema DNA ahelaga komplementaarsed uued DNA ahelad, replikatsioon lõppeb, kui DNA-ahelalt on sünteesitud uus DNA molekul. DNA replikatsiooni komponendid Replikatsioonikahvel (DNA ahelad lahus) DNA topoisomeraasid (muudavad DNA spiralisatsiooni) DNA helikaasid (teevad ahelad lahti) SSB valgud (kaitsevad üksikahelalist DNA-d) Ahelate eristamine Liiderahel (pidev süntees DNA püolümeraas III- abil) Mahajääv ahel (moodustub praimosoom, süntees fragmentidena) Okazaki fragmendid RNA praimer (sünteesitakse RNA polümeraasiga) DNA polümeraas III (viib läbi DNA matriitssünteesi) DNA fragmentide ühendamine
olemasolu pole obligatoorne bakteri funktsioneerimiseks. Plasmiidide replikatsioon võib toimuda kromosomaalsest DNA-st sõltumatult 10. Milleks on bakteri DNA-s OriC järjestus? Mikroobide genoomi replikatsioon algab DNA ühest punktist (origin – algus), mida nim oriC lookuseks. Bakterite genoomis sisaldub üks või mitu oriC lookust. Lookus seondub bakteri tsütoplasma membraaniga . Samas kohas lahknevad DNA ahelad ja tekib replikatsioonikahvel. 11. Kus esineb rõngasreplikatsioon? Bakteriofaagides ja plasmiidides. Eriti tähtis on see replikatsioonimehhanism autonoomselt paljunevates plasmiidides. 12. Kuidas kontrollitakse bakterirakus geeniekspressiooni? Replikatsiooni tasemel (vananemine, generatsiooniaeg, molekulaarne kell) Transkriptsiooni tasemel – bakterites peamine kontrollmehhanism, kõige tähtsam on operon Ensüümide aktiivsuse kaudu 13
3'-otsa töötlemiseks vajalikke tegureid; kattuvad Cajali kehadega või on nende läheduses. Nende kehakeste alajaotus, mis ei ole seostunud cajali kehakestega sisaldavad värskelt sünteesitud RNAd 2. DNA replikatsioon Kogu rakutuumas leiduva DNA kahekordistamine, toimub rakutsükli S faasis Rakkude jagunemist ettevalmistav etapp 1. Komplementaarne – A -T ja G - C 2. Kindla suunaga – uue ahela süntees 5’ – 3’ suunas 3. Toimub kahel ahelel paralleelselt – replikatsioonikahvel; juhtivat ahelat ehk liiderahelat sünteesitakse ühe pideva lõiguna; viivisahelat (maha jäävat) sünteesitakse 200 bp lõikudena (Okazaki fragmendid) 4. Võib olla mitu alguspunkti – kromosoomide piirkonnad, kust DNA repl. algab; prokarüootide DNA-l on üks alguspunkt, eukarüootides igal kromosoomil mitu (arv sõltub liigist, rakutüübist ja arengustaadiumist), neil algab mitmest kohtadest, kuna muidu kestaks protsess liiga kaua 5
- N-aluste järjestus geenile on unikaalne Kaksikahelaline DNA dupleks - DNA-l 2 nukleotiidiahelat mis koos nõrkade H-sidemetega - Moodustuvad N-aluspaarid - Seetõttu on DNa ahelad komplementaarsed - DNA ahelad antiparalleelsed 10.DNA replikatsioon - DNA replikatsioon on poolkonservatiivne – mõlema vanemahela info põhjal sünteesitakse uus komplementaarne ahel DNA replikatsiooni komponendid Replikatsioonikahvel (DNA ahelad lahus) Moodustub replikatsiooi käigus – replikatsioon toimub bakteri kromosoomis kahesuunaliselt ning moodustub kaks Y-kujulist struktuuri e replikatsioonikahvlit - DNA topoisomeraasid (muudavad DNA spiralisatsiooni - DNA helikaasid – teevad ahela lahti - SSB valgud – kaitsevad üksikahelalist DNAd Ahelate eristamine - Liiderahel – pidev süntees DNA püollümeraas II abil - Mahajääv ahel – moodustub parimosoom, süntees fragmentidena
replikatsioon? Transkriptsioon ja replikatsioon ei ole bakterirakus ajaliselt lahutatud. Eriti tihedalt on need protsessid seotud kiiresti kasvavates bakterirakkudes, kus korraga töötavad 6 või rohkem replikatsioonikahvlit. Replikatsiooni kiirus on transkriptsiooni kiirusest ligikaudu 20 korda suurem. Seega peaksid RNA-d ja DNA-d sünteesivad ensüümkompleksid omavahel kokku põrkuma. Eelistatult toimuvad replikatsioon ja transkriptsioon samasuunaliselt. Kui replikatsioonikahvel jõuab järele RNA polümeraasile, pühib ta selle teelt ning liigub edasi. Promootorilt toimub uus transkriptsiooni initsiatsioon. Kui replikatsioon ja transkriptsioon toimuvad vastassuunaliselt, on replikatsioonikahvli liikumine tugevasti pidurdatud ning ka sel juhul toimub RNA polümeraasi kõrvaldamine DNA ahelalt. Lisaks, kui replikatsioon ja transkriptsioon toimuvad vastassuunaliselet ning replikatsioon toimub operoni lõpust promootori suunas,
Ühel kromosoomil liigub palju replikatsiooni kahvleid. S-faasis olevas rakus osa replik. ühikuid aktiveeritakse S-faasi alguses, osa aga lõpus. On teada, et tugevasti kokku pakitud nn. heterokromatiin on see osa kromatiinist, mis replitseeritakse S-faasi lõpus. 1. DNA replikatsioon DNA replikatsioon on matriitssüntees, mille tulemusena saadakse ühest DNA molekulist kaks ühesuguse nukleotiidse järjestusega DNA molekuli. Juhtiv ahel on DNA ahel, millel replikatsioonikahvel liigub 3’-5’ suunas. See võimaldab komplementaarse ahela sünteesi 5’-3’ suunas. Juhtival ahelal "loeb" DNA polümeraas DNAd pidevalt ning liidab pidevalt ka uusi nukleotiide. Mahajääv ahel on DNA kaksikheeliksi ahel, millel replikatsioonikahvel liigub 5’-3’ suunas. (DNA polümeraas sünteesib uut ahelat ainult 5’-3’ suunas). Mahajääv ahel sünteesitakse fragmentide kaupa. Algsele DNA ahelale liidetakse RNA praimer ning uut ahelat sünteesitakse vastupidiselt
kas tioredoksiini või glutaredoksiini osalusel. Tümidiinnukleotiidide (dTMP) süntees DNA sisaldab uratsiili asemel tümiini, mis sünteesitakse desoksüribonukleotiidi kujul, mille otseseks sünteesiks kasutatakse dUMP, mille eellasteks on UDP või CDP. DNA replikatsioon Uute polünukleotiidahelate süntees, kus DNA molekulist sünteesitakse identsed koopiad. DNA kaksikahel peab lahti keerduma, et tagada DNA-polümeraasile juurdepääs üheahelalistele templeitidele ehk sabloonahelatele. replikatsioonikahvel [Y-kujuline replitseeruva DNA piirkond, kus tekivad kaks tütarahelat ning need lahknevad] DNA replikatsioon on: · semikonservatiivne tütarmolekulide üks ahel on pärit emamolekulist ja teine on täiesti uus · kahesuunaline kahesuunaline replikatsioon sisaldab kahte replikatsioonikahvlit, mis liiguvad vastassuunas · poolkatkendlik juhtivahel kopeerub katkematult, mahajääv ahel kopeerub segmentide kaupa
väljalõikereparatsioon (kahjustatud lämmastikaluse või nukleotiidi väljalõikamine), replikatsioonijärgne valepaardumisi kõrvaldav DNA „mismatch“ reparatsioon MMR („mismatch“ korrigeerib DNA järjestust replikatsioonijärgselt, kõrvaldades valestipaardunud nukleotiide sellest DNA ahelast, mida pole jõutud veel metüleerida), rekombinatsiooniline reparatsioon (see on RecA valgust sõltub ning käivitub rakus SOS vastuse tulemusena. DNA replikatsioonikahvel peatub, kui DNA ahelas on kas DNA kahjustus, üksikahelaline või kaksikahelaline katke). 77. SOS vastus bakterites. Üksikahelalise DNA teke aktiveerib RecA valgu – moodustub RecA-ssDNA nukleoproteiinne filament. Aktiivne RecA stimuleerib transkriptsiooni negatiivse regulaatori LexA proteolüüsi, mis inaktiveerib LexA. Transkriptsioonitase suureneb oluliselt geenidelt, mis kodeerivad osasid DNA reparatsioonil ja DNA sünteesil osalevaid ensüüme
Transkriptsioon ja replikatsioon ei ole bakterirakus ajaliselt lahutatud. Eriti tihedalt on need protsessid seotud kiiresti kasvavates bakterirakkudes, kus korraga töötavad 6 või rohkem replikatsioonikahvlit. Replikatsiooni kiirus on transkriptsiooni kiirusest ligikaudu 20 korda suurem. Seega peaksid RNA-d ja DNA-d sünteesivad ensüümkompleksid omavahel kokku põrkuma. Eelistatult toimuvad replikatsioon ja transkriptsioon samasuunaliselt. Kui replikatsioonikahvel jõuab järele RNA polümeraasile, pühib ta selle teelt ning liigub edasi. Promootorilt toimub uus transkriptsiooni initsiatsioon. Kui replikatsioon ja transkriptsioon toimuvad vastassuunaliselt, on replikatsioonikahvli liikumine tugevasti pidurdatud ning ka sel juhul toimub RNA polümeraasi kõrvaldamine DNA ahelalt. Lisaks, kui replikatsioon ja transkriptsioon toimuvad vastassuunaliselet ning replikatsioon toimub operoni lõpust promootori suunas, on
16. Mis on replikon? Replikon on replitseerunud DNA-segment, mis on lähtunud ühest alguspunktist (koht, mis on läbi teinud replikatsiooni ehk koht, kust algab kaksikahelalise DNA lahtiharutamine). Hiljem liidetakse kõik replikonid tagasi kokku. Replikatsiooni ajal on inimese kromosoomides kuni 10 000 replikoni. 17. Kirjelda replikatsioonikahvli liikumist Struktuur, mis moodustub sünteesilookuse juures, kus kaheahelaline DNA läheb üle üheahelaliseks, kannab nimetust replikatsioonikahvel. Replikatsioonikahvel liigub ahela sünteesiga samas suunas, alati suunaga 5’-3’ ehk nukleotiide lisatakse ainult kasvava ahela 5’ otsa. Replikatsioonikahvli ette tekib positiivne superspiraal, kahvli taha tekib negatiivne superspiraal. DNA süntees alati 5’ – 3’ suunaline. See tähendab, et : · Juhtival DNA ahelal (liiderahel) (leading strand) toimub DNA süntees järjepidevalt, teda pikendatakse järjepidevalt. Süntees 5’-3’ suunas.
10. DNA replikatsiooni (sünteesi) põhimõtted Duplikatsiooniprotsess, mis leiab aset matriitsilt kopeerimise tulemusel. Näiteks DNA de novo süntees. Replikatsiooni etapid: ensüüm helikaas lõhub DNA biheeliksi, ensüüm DNA-polümeraas seondub DNA ahelaga, DNA-polümeraas sünteesib mõlema DNA ahelaga komplementaarsed uued DNA ahelad, replikatsioon lõppeb, kui DNA-ahelalt on sünteesitud uus DNA molekul. 11. DNA replikatsiooonikahvel, osalevad ensüümid Replikatsioonikahvel: Replikatsioon toimub alguspunktist lähtuvalt kahes suunas, moodustub kaks Y-kujulist struktuuri. Osalevad ensüüm helikaas ja ensüüm DNA-polümeraas. 12. Okazaki fragmendid, fragmentide ühendamine Okazaki fragment (ingl. Okazaki fgragment)- DNA-sünteesil DNA-viivisahelal sünteesitud fragment (prokarüootidel 1000–2000 ja eukarüootidel 100–200 bp), mis koosneb lühikesest RNA praimerist ja järgnevast DNA-polünukleotiidist.
Eksperimentaalselt leidis kinnitus semikonservatiivne mudel. KONSERVATIIVNE MUDEL: algselt kaksikheeliksilt sünteesitakse uus; ühes DNA molekulis on koos vanad ja teises uued ahelad 30 DISPERSIIVNE MUDEL: mõlemas DNA molekulis sisaldavad DNA ahelad segu vanadest ja uuesti sünteesitud lõikudest 50. DNA replikatsiooni initsiatsiooni mehhanism. DNA replikatsioon algab oriC järjestustelt, kus esmalt moodustub DNA ahelate lokaalsel lahkuminekul replikatsioonikahvel. Toimub DNA ahelate lahtikeerdumine ja praimeri süntees. DNA replikatsioonikahvli avamine toimub A-T rikastest regioonidest initsiaatorvalgu DnaA toimel. Järgnevalt toimub DnaA-valkude kooperatiivne liitumine, moodustub 20-40 polüpeptiidist koosnev valguline kompleks, mille ümber seondub oriC piirkond. ATP juuresolekul toimub avatud kompleksi moodustumine. Ahelate lahknemine algab kolme tandeemse
põhjustab konformatsioonilisi muutusi helikaasis. DNA primaas seob järgnevalt helikaasi, nii et moodustub primosoom. Primaas sünteesib väikese, 10-12 RNA, millele DNA polümeraas hakkab sünteesima juurde nukleotiide. Polümeraas III lisab nukleotiide 5' 3' suunas mõlemal ahelal, alustades RNA praimerist. RNA praimer hiljem eemaldatakse ja asendatakse DNA polümeraasiga. Vahemik säilitakse ligaasi poolt. Üheahelaine DNA stabiliseeritakse kogu protsessi vältel spetsiaalse valguga. Kui replikatsioonikahvel kogu aeg avaneb, siis ühe DNA ahela süntees on pidev ehk toimub kogu aeg. Teisel juhul läheb ta kahvlist eemale ja on teistpidi (süntees toimub väikeste fragmentidega, mis omavahel pandakse kokku). Ahelate peal DNA süntees ongi erinev oma mehhanismilt. Igale fragmendile sünteesitakse alati juurde oma väike RNA (et süntees saaks toimuda). Süntees toimub sinnamaani kui pikk konkreetne ahel on. Tegelikult kahe ahela
Tekib üheahelaline katkemine ja sealt ei saaks replikatsioon edasi toimuda. Kui on 84 ühes ahelas lihtsalt tömp ots. siis on taastumiseks vaja homoloogilist rekombinatsiooni. On tekkinud juba kaheahelaline katkestus. Toimumine: - RuvBCD liitub tömbile otsale - hakkab liikuma ja liigub, lagundab hii-nim sealt edasi lagundab üht ja tekib RecA filament. - see katalüüsib kaksikahela komplementaarsust otsides, paardub ühe ahelaga - siis ongi replikatsioonikahvel taastatud ja replikatsioon saab edasi minna replikatsiooniensüümide fn: kataüüsida liikumist, ühendamist Erinevused kahes mudelis: - katked ühes kromosoomis või mõlemas - lagundamine või lihtsalt ahela vahetus - kaks või üks Holliday koht - mõlemad liiguvad edasi - katkestused – vastupidi, et kumba peab lõikama, et tekiks rekombinatsiooni produkt. RecBCD aitab võõrast DNA-d lagundada, taastada replikatsioonikahvel ja korraldada rekombinatsiooni
eksonukleaaside toimel. DNA ahelate lahtikeeramisel osaleb helikaas UvrD. ssDNA-le sünteesib komplementaarse DNA ahela DNA polümeraas III kompleks. MutS ja MutL homolooge on leitud ka eukarüootsetes rakkudes. MutS homoloogide defektsus võib neis rakkudes põhjustada vähi teket (näit. soolevähki). Rekombinatsiooniline DNA reparatsioon Rekombinatsiooniline DNA reparatsioon on RecA valgust sõltuv ning käivitub rakus SOS vastuse tulemusena (sellest tuleb täpsemalt juttu allpool). DNA replikatsioonikahvel peatub, kui DNA ahelas on kas DNA kahjustus, üksikahelaline või kaksikahelaline katke. RecA valk aktiveerub kokkupuutes ssDNA-ga ning viib kontakti rekombineeruvad DNA molekulid. RecA soodustab DNA ahelate ülekannet, aitab neil paarduda ning osaleb DNA ahelate hargnemiskoha migratsioonil. RecA homolooge on leitud ka eukarüootides. Näiteks Rad51 defektsus põhjustab hiire embrüol letaalset fenotüüpi ning kõrgenenud tundlikkust ioniseeriva kiirguse suhtes
eksonukleaaside toimel. DNA ahelate lahtikeeramisel osaleb helikaas UvrD. ssDNA-le sünteesib komplementaarse DNA ahela DNA polümeraas III kompleks. MutS ja MutL homolooge on leitud ka eukarüootsetes rakkudes. MutS homoloogide defektsus võib neis rakkudes põhjustada vähi teket (näit. soolevähki). Rekombinatsiooniline DNA reparatsioon Rekombinatsiooniline DNA reparatsioon on RecA valgust sõltuv ning käivitub rakus SOS vastuse tulemusena (sellest tuleb täpsemalt juttu allpool). DNA replikatsioonikahvel peatub, kui DNA ahelas on kas DNA kahjustus, üksikahelaline või kaksikahelaline katke. RecA valk aktiveerub kokkupuutes ssDNA-ga ning viib kontakti rekombineeruvad DNA molekulid. RecA soodustab DNA ahelate ülekannet, aitab neil paarduda ning osaleb DNA ahelate hargnemiskoha migratsioonil. RecA homolooge on leitud ka eukarüootides. Näiteks Rad51 defektsus põhjustab hiire embrüol letaalset fenotüüpi ning kõrgenenud tundlikkust ioniseeriva kiirguse suhtes
annaabi.ee 
