1. Selgita ,,tömbi" ja kohessiivse otste põhimõtet (,,blunt" ja ,,sticky ends") Need otsad saadakse erinevate restriktsiooni tüüpide tulemusena. Tömbi otstele on iseloomulik komplimentaarse aluste baaspaari olemasolu. Lihtsam ligeerida vektoriga. Probleemiks DNA võib endast ümber pöörata ning valesti sisse minna. Kohessiivsed otsad ilmuvad astmelise katkestuste tõttu (trepi sarnased otsad.). Väga kergesti kleepuvad omavahel: aitavad bakteriofaagile moodustada rõbjast struktuuri. 2. Mis rolli mängib DNA metüleerimine restriktsiooni analüüsis? Metüleerimise abil kaitstakse DNA restriktsiooni eest. Nii nt.kaitseb E.coli oma genoomset DNA enda poolt toodetud ...
+RNA Ühekomponentne 11,5 kb Cap-struktuur ja poly(A) saba Elutsükkel Mõju peremeesrakule Translatsiooni ja transkriptsiooni mahasurumine Viirus-indutseeritud apoptoos Vektorites on infektsioon persistentne ja mittetsütotoksiline Kasutamine geenitehnoloogias Head mudelobjektid: 1. Lihtne genoom 2. Laboratoorsed tüved inimesele vähepatogeensed 3. suur mahutavus (kuni 6 kb) 4. Kasutatavad paljudes eri rakutüüpides Kasutamine: 1. Geeniekspressiooni vektor 2. Rekombinantsed vaktsiinid Vektor Viirus-sarnane partikkel geeniekspressioon
Transgeensed taimed Tehnogeneetiliselt muundatud organismid Organismid, kelle genoomi on siirdatud mõne võõrliigi geene. Avalduvad uued tunnused, mis päranduvad ka järglastele. Ilmneb mingi uus, mõnele teisele liigile omane tunnus. Näiteks: sebrakalad Transgeensed mikroorganismid Siiratav geen tuleb ühendada niisugusesse DNAvõi RNA kompleksi, mis saab siseneda rakku ja integreeruda selle genoomi. Geenivektorid ehk siirdajad. Esimesed rekombinantsed viirused ja plasmiidid loodi 1973. aastal Transgeensed loomad Geenivektorite ülekandeks kasutatakse viirusi või siirdatakse vajalik geen mikropipeti abil otse viljastatud munarakku. Esimene transgeenne hiir saadi 1981.a. roti kasvuhormooniga kasvas 2 X suuremaks. Transgenees inimesel on nii teaduslikust kui ka eetilisest küljest vastunäidustatud. Transgeensed taimed Peamiselt põllumajanduslikel
Ligaas -ensüüm, mis ühendab kovalentse sidemega DNA-fragmentide ahelate otsad Kimäär - biol. erineva genotüübiga ja eri organismidest pärit rakkudest koosnev organism. Geeninokaut - geenitehnoloogiliselt rikutud (,,nokauti löödud") geeniseisund Transg. Org. Mikroorganismid, bakterid Uute omadustega organismide abil toodetakse bioloogiliselt aktiivseid aineid: raviühendeid,antikehi,verehüübimisfaktoreid,kasvufaktoreid Nende loomine põhineb rekombinantse DNA tehnoloogial. Esimesed rekombinantsed viirused ja plasmiidid loodi 1973.a Transg. Loomad Saab kasut. Mudelitena inimese pärilike haiguste uurimiseks ja uute ravimeetodite rakendamiseks. Et saavutada: putukaresistentsus Bt-toksiini määrav geen on viidud taimesse ja mürke polegi vaja (tomat, mais, puuvill, kartul), viirusresistentsus, (papaia) herbitsiidiresistentsus (peet, mais, puuvill, lina, raps, soja, riis) suurem saagikus, lamandumis- ja külmakindlus, viljade pikem säilivusaeg Transg. taimed
sarnase või identse DNA molekuli, kus ei ole toimunud katkestust. Pärast ahela ülekannet tekivad X-kujulised Holliday struktuurid, mis ühendavad kahte DNA molekuli. Olenevalt sellest, kuidas ensüümid ühenduskohti lõikavad, võib toimuda kromosomaalne ristsiire. Selline protsess leiab aset meioosis. DNA parandamisel toimuva homoloogilise rekombinatsiooni puhul asendatakse tavaliselt kahjustunud DNA lõiguga, mis oli seal enne kaheahelalise katkestuse teket. Rekombinantsed gameedid moodustuvad homoloogiliste kromosoomide ristsiirde tagajärjel. Ristsiire toimub esimese meiootilise jagunemise profaasi staadiumis, kui homoloogilised kromosoomid omavahel paarduvad. Kuna selleks ajaks on geneetiline materjal kahekordistunud, osalevad protsessis neli homoloogilist kromatiidi, moodustades tetraadi. Samas toimub konkreetne ristsiire kahe homoloogilise kromatiidi vahel. Sellest kohast ülejäänud kaks kromatiidi ei rekombineeru
10 alleelist V A B Joonis VI 1. Mis toimub joonisel märgitud punktides 1-4? 1. Lõigatakse lahti bakterite rõngaskromosoomid; 2. Liidetakse, igasse kromosoomi erinev lõik; 3. Bakterid paljundatakse; 4. Kolooniad eraldatakse kultuuriklaasidesse ja viiakse hoidlasse 2. Millistes punktides asuvad bakterid on rekombinantsed? 2 3. Millistes punktides asuvad bakterid on transgeensed? 3 4. Millistes punktides asuvad bakterid on geneetiliselt muundatud? 5. Kuidas nimetatakse ensüüme, mille abil lõigatakse DNA ahelad lahti? restriktaas 6. Kuidas nimetatakse ensüüme, mis liidavad ,,kleepuvate otstega" DNA lõigud kokku? ligaas VI 1. 2. 3.
Miks muundatakse? GMO võimaldab: · suurendada organismide haiguskindlust ja vastupanuvõimet kahjuritele · parandada kultuurtaimede maitseomadusi ja saagikust · pikendada toitainete säilimisaega Transgeensed mikroorganismid · Transgeensete organismide loomine põhineb rekombinantse DNA tehnoloogial. · Siiratav geen tuleb ühendada niisugusesse DNA- või RNA kompleksi, mis saab siseneda rakku ja integreeruda selle genoomi. · Esimesed rekombinantsed viirused ja plasmiidid loodi 1973. aastal. · 1970. aastate teisel poolel hakati looma inimese ja mõne teise liigi genoomipanku bakterites ja pärmseentes. · Esimene inimese valku sünteesiv bakteritüvi saadi 1978a. Selleks oli hormoon insuliin. Transgeensed loomad · Esimene selline imetaja loodi aastal 1981. · Selleks oli hiir, kelle genoomi viidi roti kasvuhormooni geen. · Neid kasutatakse geenide avaldumise, nende produktide toimeviiside ja -teede uurimiseks.
Teadaolevad polümorfsed lookused (Rh; ABO jt) 6. Aheldusuuringu (linkage study) põhimõte? Kirjelda, kellel ja kuidas uuringut teostatakse? Aheldatuse uuringu käigus vaadeldakse, kas uuritav geen pärandub pk pk koos meie poolt valitud markeriga ehk kas esineb aheldatus markeri ja haigusseoselise geeni vahel. Analüüsil jälgitakse haiguse avaldumist sugulaste seas ja määratakse ära rekombinantsed ja mitterekombinantsed genotüübid. Aheldusanalüüs kasutab populatsioonis harvasid, kõrge penetrantsusega ehk sageli avalduvaid mutatsioone. 7. Mida tähendab ahelduse tasakaalustamatus? Kellel ja kuidas seda uuritakse? Ahelduse tasakaalustamatus (LD linkage disequilibrium) on mõiste, mis kirjeldab mittejuhuslikku alleelset assotsiatsiooni. LD populatsioonigeneetika termin, mis tähistab kahes või enamas lookuses olevate alleelide mittejuhuslikku koosesinemist
TRANSGEENSED MIKROORGANISMID - transgeensete organismide loomine põhineb rekombinantse DNA tehnoloogial. Siiratav geen tuleb ühendada niisugusesse DNA- või RNA-kompleksi, mis saab siseneda rakku või integreeruda sele genoomi. Selliseid DNA- konstrukte nim. geenivektoriteks ehk -siirdajates. Eesimesed rekombinantsed viirused ja plasmiidid loodu 1973. aasta. BAKTERITEL ei ole tuuma; seda asendab tumapirkond, milles paikenb üks rõngasjas kromosoom. Lisaks leidub bakterirakus väiksemaid DNA rõngaid- plasmiide, mida kasutatase geenivektorite loomisel. Rakendusbioloogilises suunas hakati otsima võimalusi kasutada transgeenseid baktereid meditsiiniliselt oluliste inimese valkude tootmiseks. Inimese rakkudest eraldatakse huvipakkuva geeni mRNA ja
RESTRIKTAAS- ensüümid, mis lõikavad DNA molekuli kaksikahelat kindlate järjestuste kohalt. Enamik lõikab DNA mõlemat ahelat vastava järjestuse eri otstest. Kui sama restriktaasiga töödelda erinevat päritolu DNA-d, siis on tekkinud fragmentidel komplementaarsed üheahelalised (kleepuvad otsad). Kui need fragmendid lahuses kokku viia, siis paardumisel nad ühinevad. LIGAAS- selle ensüümi toimel ühinevad ahelate otsad ka kovalentsete sidemetega ja rekombinantsed molekulid ongi moodustunud. GEENIVEKTOR- ehk siirdaja, DNA konstrukt. Kui soovitud geen on välja lõigatud, ühendatakse ta selisesse DNA-sse, mis saab siseneda rakku ja integreeruda selle genoomi. Geenivektorina saab kasutada bakterite plasmiide, viiruste DNAd või RNAd ja muid molekule. PLASMIID- rõngas DNA-d, milles sageli antibiootikumiresistentsust andev geen. VIIRUSVEKTOR- viirustel põhinev geenide ülekandesüsteem ehk viib soovitud geenid rakku
· Äädikakärbse geenid on kaardistatud · Ta on bioloogiliselt üks läbiuurituimaid organisme Geenivahetuse olemus ja tähtsus: · toimub meioosi esimeses profaasis · homoloogilised kromosoomid vahetavad vastastikku osasid · toimub DNA molekulide katkemine ja osade vahetus ü tekivad uued geenikombinatsioonid ü tagatakse pärilik muutlikkus ü moodustub materjal loodusliku valiku jaoks populatsioonides ü tekivad REKOMBINANTSED ISENDID(geenivahetuse tagajärjel moodustunud isendid) Aheldunud pärandumise olemus ja tähtsus: ü põhineb faktil, et ühes kromosoomis lähestikku asuvad geenid päranduvad koos. ü Tagab selle, et evolutsioonis ennast õigustanud geenikombinatsioonid jäävad muutumatuks. ü Välditakse kõikvõimalike kahjulike geenikombinatsioonide teket. ü Sarnase toimega geenid(geeniperekonnad) peaksid päranduma koos.
3. Kirjuta lühendi GMO pikem mõiste, mida see tähendab. GMO ehk geeniliselt muundatud organismid tavakeeles populaarne väljend transgeense ehk siirdgeense organismi tähistamiseks. 4. Mis põhjustab sebrakala fluorestsentsvärvi? Sebrakalale siirdatud genoom on fluorestseeruvat valku kodeeriv geen meduusilt, mis põhjustab kala fluorestsentsvärvuse. 5. Millal loodi esimesed rekombinantsed viirused ja plasmiidid? Esimesed rekombinantsed viirused ja plasmiidid loodi 1973. aastal. 6. Miks osutusid genoomipangad tehnogeneetilistes uuringutes ja rakenduste väljatöötamisel äärmiselt kasulikuks? Genoomipangad osutusid tehnogeneetilistes uuringutes ja rakenduste väljatöötamisel äärmiselt kasulikuks, sest neist saab alati eraldada vajalikul määral paljundatuna kindla DNA-fragmendi (geeni, selle osa või mittegeense lõigu). 7. Kes oli esimene transgeenne imetaja?Millal loodi?
fenotüübiga järglasi. Fenotüüpide oodatav suhe 9:3:3:1, tegelik 23.3:1:1:6.8. Kõrvalekalle tulenes: õite värvust ja tolmuterade kuju määravad geenid olid aheldunud. 30. Geneetilise materjali rekombineerumine ristsiirde teel. Ristsiire ehk crossing over – homoloogiliste kromosoomide kromatiidide osade vahetamine. Ristsiire toimub meioosi algfaasis, kui homoloogiliste kromosoomipaaride vahele on moodustunud ühendused ehk kiasmid. Rekombinantsed gameedid moodustuvad homoloogiliste kromosoomide ristsiirde tagajärjel. Iga ristsiirde toimumise tagajärjel on neljast kromatiidist rekombinantsed kaks. 31. Kas kõrge rekombinatsioonisagedus viitab uuritavate geenide üksteisele lähestikku või eemal paiknemisele? Põhjendage. Geenid, mis paiknevad üksteise suhtes lähestikku, on tugevamalt aheldunud ning rekombineeruvad harvemine. Seega võimaldab geenidevahelise rekombinatsiooni sagedus hinnata nendevahelist
kirjutamisviis. Oletame, et heterosügootsel taimel on kaks dominantset alleeli R ja L ning kaks heterosügootset alleeli r ja l. Kui me kirjutame nende taimede genotüübi R L / r l, tähendab see seda, et ühelt vanemalt pärandusid omavahel aheldunud on alleelid R L ning teiselt vanemalt alleelid r l. Kui taimede genotüüp on kirjutatud R l / r L, on omavahel aheldunud dominantsed ja retsessiivsed alleelid. Rekombinatsioon toimub ristsiirde tulemusena Rekombinantsed gameedid moodustuvad homoloogiliste kromosoomide ristsiirde tagajärjel. Ristsiire toimub esimese meiootilise jagunemise profaasi staadiumis, kui homoloogilised kromosoomid omavahel paarduvad. Kuna selleks ajaks on geneetiline materjal kahekordistunud, osalevad protsessis neli homoloogilist kromatiidi, moodustades tetraadi. Samas toimub konkreetne ristsiire kahe homoloogilise kromatiidi vahel. Sellest kohast ülejäänud kaks kromatiidi ei rekombineeru
33. Pagaripärmi Saccharomyces cerevisiae elutsükkel. S. cerevisiae kasutamine ristsiirete uurimisel. Elutsüklis vaheldub haplodne ja diploidne elujärk. Saab paljuneda mittesuguliselt pooldudes ja ka suguliselt. Suguline paljunemine leiab aset, kui kaks haploidset rakku ühinevad, tekib diploidne rakk, mis läbib meioosi. Meioosi profaasis toimub kromatiidide ristsiire ja jagunemisel tekib neli haploidset askospoori, kellest kaks on rekombinantsed. Need neli askospoori on alguses ühises kotikeses – askuses. Askospoorid on ühe meioosi protsessi tulemused, seega on nende nelja askospoori vaatluse lihtne järgi vaadata, mis meioosis toimus. Askospoorid pannakse erinevatele söötmetele ja kolooniate järgi saab õelda, millised on rekombinantsed ja millised vanemate sarnased. 34. Mida näitavad homoloogiliste kromosoomide vahelised kiasmid? Ristsiirete arvu ja asukohta
DNA-fragmendid. Selle metoodika eelduseks oli omakorda restriktsiooniensüümide ehk restriktaaside avastamine bakterites. Restriktsiooniensüümid ehk restriktaasid on omapärased ensüümid, mis lõikavad DNA molekuli kaksikahelast kindlate järjestuste kohalt. Enamik lõikab DNA mõlemat ahelat vastava järjestuse eri otsadest. Ensüüm ligaas toimel ühinevad ahelate otsad ka kovaletsete sidemetega ja rekombinantsed moelkulid ongi moodustunud. Osa geenitenoloogiliste meetodite juures on asendamatuks abivaheniks osutunud pöördtranskriptaas ehk revertaas, mis on ensüüm, mis katalüüsib DNA sünteesi RNA järgi, s.t. RNA kopeerimist DNA-ks. Transgeensed organismid ehk geneetiliselt muundatud organismid (GMO) organismid, kelle genoomi on siiratatud mõne võõrliigi geene, mis neis organismides avalduvad ja ka järglastele päranduvad. Kuid on ka teist tüüpi GM-organismie
kleepuvate otste vahele tekivad vesiniksidemed. Ensüüm ligaasi abil ühendat eri päritolu lõigud kovalentsete sidemetega, tekib rekombinantne DNA molekul. Bakterid kaitsevad end sedasi viiruste eest. 46. DNA kloneerimise etapid. 1)DNA lõigatakse restriktaasi abil fragmentideks ja segatakse bakterite plasmiididega, mis on lahti lõigatud sama restriktaasiga 2)Iga plasmiid ühineb võõra fragmendiga. Ligaasi toimel ühinevad ahelate otsad 3)Bakterid võtavad rekombinantsed plasmiidid endasse, saadakse kloonbakterite kogumid 4)Kolooniad eraldatakse. Siiratud fragment(DNA) paljuneb koos bakteritega, saadakse DNA-pank. 47. Mis on cDNA? Kodeeriv DNA e eksonid. Paiknevad eukarüootide geenis vaheldumisis intronite e mittekodeerivate aladega. Neis oleva nukleotiidijärjestuse alusel järjestat ribosoomis aminohapped sünteesitavasse valgumolekuli. In genoomis on cDNAd ainult 2%. 48. DNA sekveneerimise põhimõte. Sekveneerimine on DNA nukleotiidse
värvus & tolmuterade kuju. Punaste õite, pikkade tolmuteradega ristamisel valgete õite, ümarate tolmuteradega punaste õitega, piklike tolmuteradega punane õievärv & tolmuterade piklik kuju domonantsed tunnused. Hübriidide iseviljastumisel 4 fenotüübiga järglasi. Fenotüüpide oodatav suhe 9:3:3:1, tegelik 23,3:1:1:6,8. Kõrvalekalle tulenes: õite värvust & tolmuterade kuju määravad geenid olid aheldunud. 30. Geneetilise materjali rekombineerumine ristsiirde teel. Rekombinantsed gameedid moodustuvad homoloogiliste kromosoomide ristsiirde tagajärjel. Protsessis 4 homoloogilist kromatiidi (geen.materjal 2*) tetraat. Iga ristsiirde toimumise tagajärjel 4 kromatiidist rekombinantsed 2. Katsed pagaripärmiga Saccharomysec cerevisiae. 31. Kas kõrge rekombinatsioonisagedus viitab uuritavate geenide üksteisele lähestikku või eemal paiknemisele? Põhjendage. ?! Geenid, mis paiknevad üksteise suhtes lähestikku, on tugevamalt aheldunud ning
eukarüootseid vektoreid, mis põhinevad enamasti eukarüoodi viiruste genoomidel. Huvipakkuvat DNA lõiku on võimalik vektorisse viia sel viisil, et nii vektorit kui ka seda DNA-d, millest soovitakse paljundada huvipakkuvaid geene, töödeldakse restriktaasidega. Restriktaasid on ensüümid, mis teevad DNA ahelatesse katked kindla nukleotiidse järjestuse kohalt. Seejärel liidetakse huvipakkuva DNA lõigu ja vektori DNA ahelate otsad ensüümiga DNA ligaas. Saadakse rekombinantsed DNA molekulid, mida on võimalik paljundada kas siis bakteri või eukarüoodi rakus. Tänu täiustunud tehnoloogiale, mis võimaldab üha kiiremini ja odavamalt määrata DNA nukleotiidset järjestust, on paeguseks sekveneeritud paljude organismide genoomi primaarjärjestus (nukleotiidne järjestus). Seisuga jaanuar 2004 (http://www.tigr.org) oli sekveneeritud 133 bakteri, 17 arhe ja 21 eukarüoodi genoom ning sekveneerimisel olevaid genoome on sadu. Seisuga aprill 2009 (vt. www.genomesonline
eukarüootseid vektoreid, mis põhinevad enamasti eukarüoodi viiruste genoomidel. Huvipakkuvat DNA lõiku on võimalik vektorisse viia sel viisil, et nii vektorit kui ka seda DNA-d, millest soovitakse paljundada huvipakkuvaid geene, töödeldakse restriktaasidega. Restriktaasid on ensüümid, mis teevad DNA ahelatesse katked kindla nukleotiidse järjestuse kohalt. Seejärel liidetakse huvipakkuva DNA lõigu ja vektori DNA ahelate otsad ensüümiga DNA ligaas. Saadakse rekombinantsed DNA molekulid, mida on võimalik paljundada kas siis bakteri või eukarüoodi rakus. Tänu täiustunud tehnoloogiale, mis võimaldab üha kiiremini ja odavamalt määrata DNA nukleotiidset järjestust, on paeguseks sekveneeritud paljude organismide genoomi primaarjärjestus (nukleotiidne järjestus). Seisuga jaanuar 2004 (http://www.tigr.org) oli sekveneeritud 133 bakteri, 17 arhe ja 21 eukarüoodi genoom ning sekveneerimisel olevaid genoome on sadu. Genoomide sekveneerimine
üks, diploidses kaks komplekti kromosoome. 9. Ristamissuhete ettearvamine Punnetti võrgustikus Punnetti ruutmeetod genotüüpide ja nende sageduste arvutamiseks (monohübriidne ristamine). Ruudustiku lahtrites on toodud genotüübid, mille sagedus leitakse isas- ja emasgameetide ja nende sageduste korrutamisel. Gameetide ühinemine on juhuslik, seepärast nende sõltumatute sündmuste tõenäosused korrutatakse. (siia oleks näidet vaja) 10. Geenide aheldus ja rekombinantsed gameedid Kui geenid asuvad samas kromosoomis suhteliselt lähestikku, siis on geenid aheldunud ja päranduvad edasi järglasele enamasti koos. Geenide aheldust väljendab kõrvalekalle oodatavast geenide sõltumatu lahknemise Mendeli printsiibist. füüsiliselt aheldunud-asuvad samas kromosoomi DNA niidis geneetiliselt aheldunud (lahknevad sõltumatult teineteisest). Teema 2. Otsegeneetika: geenilt tunnusele. 1. DNA STRUKTUUR
Punaseõieliste piklike tolmuteradega taimede ristamisel valgeõieliste ümarate tolmuteradega taimedega raade F1 põlvkonnas vaid punaseõielised piklike tolmuteradega taimed: punane värvus ja tolmuterade piklik kuju peavad olema dominantsed tunnused. Hübriidide iseviljastumisel saadi nelja fenotüübiga järglasi, nagu dihübriidsel ristamisel võib eeldada, kuid fenotüübiline suhe erines oodatavast (9:3:3:1) suhtest. Tegelik lahknemissuhe oli 24,3:1,1:1:7,1. Kui jätta välja rekombinantsed järglased, saaksime lahknemissuhte punaseõieliste piklite tolmuteradega järglaste ja valgeõieliste ümarate tolmuteradega järglaste vajel 3:1 - nagu monohübriidsel ristamisel. Siit saab järeldada, et vaadeldavad geenid kanduvad enamasti koos sest nad on aheldunud ja rekombinantsed järglased peavad moodustama geenide ristsiirde tulemusel. F1 põlvkonna gameetide moodustumisel toimus meioosis ristsiire, mille tulemusena tekkisid
tasakaal nihutatud aktiivsete insuliini monomeeride suunas kiire toime, isoelektrilise punkti nihke tõttu lahustuvus halvem pikem efekt Peamised probleemid: süstimisest tulnud ärritused, hüpoglütseemia. Kokkuvõte 1. Insuliin on oluline glükoosi taseme kontrolliks organismis. 2. Probleemid insuliini sünteesiga organismis toovad kaasa diabeedi. 3. Diabeedi raviks on tänaseks päevaks välja töötatud insuliini analoogid - rekombinantsed insuliinid, millel on olemas insuliini efekti suurendavad modifikatsioonid. 4. Insuliini analoogid jagunevad kiire- ja/või pikatoimelisteks - enamasti on selle taga muudatused insuliini aminohapetes. 5. Tulevik diabeedikute ravis: manustamisviiside ja kasutustingimuste arendamine ning b-rakkudele suunatud ravi. QUATTROMED HTI LABORID OÜ Suurim Eesti biotehnoloogia firma nii käibe kui töötajate poolest.
omapärased ensüümid, mis lõikavad DNA molekuli kaksikahelat kindlate järjestuste kohalt. Enamik restriktaase lõikab DNA mõlemat ahelat vastava järjestuse (4-8 nukleotiidipaari) eri otstest. Kui sama restriktaasiga töödelda erinevat päritolu DNA-d, siis on tekkinud fragmentidel komplementaarsed üheahelalised (nn. kleepuvad) otsad. Kui need fragmendid kokku viia, siis otste paardumisel nad ühinevad. Ensüüm ligaasi toimel ühinevad ahelate otsad ka kovalentsete sidemetega ja rekombinantsed molekulid ongi moodustunud. Geenitehnoloogiad võimaldavad otseselt muuta indiviidide pärilikke omadusi. Tähtsaimad rakendused selles valdkonnas on transgeensete organismide (nn. GMO) loomine ja geeniteraapia (geenravi) inimesel. Peale nende põhinevad geenitehnoloogilistel meetoditel nii sünnieelne kui ka sünnijärgne pärilike haiguste molekulaargeneetiline diagnostika ja inimeste (sh. kurjategijate) tuvastamine ,,DNA- sõrmejälgede" metoodika abil. 2
diploidse tuuma korduva (näivalt mitootilise) jagunemise käigus, enne kui jõutakse tuumade haploidiseerumiseni. Meioosi teine jagunemine (haploidiseerumine) on vahepealsete jagunemistega ajaliselt ja ruumiliselt eraldatud, edasi lükatud. Võib-olla annab see rohkem aega rekombinatsioonide tekkeks. Võiks öelda, et suguline protsess on toimunud ilma nähtava sugulise paljunemiseta. Sellisel juhul on ilma viljakehade moodustamiseta kasvava seene hüüfil justkui klonaalselt tekkivad koniidid rekombinantsed venitatud ja varjatud meioosi tõttu. Paraku ei allu rekombinatsioonide lahknemine antud juhul populatsioonigeneetika seadustele (rekombinantsete koniidide ebavõrdne arvukus? rekombinantide ebavõrdne lahknemine?). Veelgi huvitavam on see, et mitootiline geenivahetus võib toimuda ka klonaalselt paljunevas pärmirakus. Sugulise paljunemiseta diploidsed pärmid on heterosügootsed (!). Mitootilised rekombinatsioonid
Valmistamist vaata tööst nr 3. (6) PCRi lõppedes (<1 tund), analüüsi 1/5 saadud produktist agaroosgeelil. Selleks pipeteeri 10 l 1 x TBE foreesipuhvrit (lilla) + 2 l PCR tuubist kokku 12 l, kanda kõik geelile. Geelile lisada kindlasti molekulmassi marker ja kontroll PCR (amplifikatsioon tühjalt pBS SK+ plasmiidilt). 12 Interpreteeri tulemus. Saadud rekombinantsed plasmiidid on valmis inserdi sekveneerimiseks T7 praimeri ja "kit"i abil (järgmises praktikumis). PCRi tulemused. Marker 100 bp pBS SK+ Kristine Arvidas Hannes Mihkel Heleen Ksenia Marko Okana Jelena Doris Mikk Anna Alex Aare Irina Inna Jana Karl Suure pildi peal insertsioon puudub, restriktsioonanalüüsiga ilmus siiski välja 800-900 nukleotiidi pikk järjestus. Lisaülesanded: 4
Punaste õite, pikkade tolmuteradega ristamisel valgete õite, ümarate tolmuteradega punaste õitega, piklike tolmuteradega punane õievärv & tolmuterade piklik kuju dominantsed tunnused. Hübriidide iseviljastumisel 4 fenotüübiga järglasi. Fenotüüpide oodatav suhe 9:3:3:1, tegelik 23,3:1:1:6,8. Kõrvalekalle tulenes: õite värvust & tolmuterade kuju määravad geenid olid aheldunud. 30. Geneetilise materjali rekombineerumine ristsiirde teel. Rekombinantsed gameedid moodustuvad kromosoomide ristsiirde tagajärjel, mis toimub meioosi I profaasis. Ristsiirde käigus vahetavad kaks kromatiidi oma vahel justkui lõike (vahetusse minevad osad on kiasmidega ühendatud). Homoloogilised kromosoomid paarduvad, kuna geneetiline materjal on kahekordistunud, moodustub tetraad protsessis osalevad 4 homoloogilist kromatiidi. Ristsiire toimub siiski kahe vahel, seega iga ristsiirde tagajärjel on neljast kromatiidist rekombinantsed 2
On DNA kloneerimise teel saadud valk. Selliseid valke saab toota nt bakterite abil või transgeensete loomade abil. Mis on cDNA? cDNA (komplimentaarne DNA) on pöördtranskriptsiooniga saadud DNA koopia. Pöörd-transkriptaas on ensüüm, mille abil sünteesitakse mRNA’lt cDNA’d. cDNA’d kasutatakse eukarüootsete geenide kloonimiseks prokarüootsetes organismides. Bakteri rakkudesse geenide viimisel peame me mRNA alusel tegema DNA. Millised on kloneeritud DNAde kasutusalad tänapäeval? Rekombinantsed valgud on meile väga praktilised, kuna saame neist toota erinevaid ravimeid nt. insuliini. Kasutatakse veel toidutööstuses ensüümid (piim, juust), keskkonnakaitses (toksiliste jääkide likvideerimine bakterite abil). Kloonitud geenid on kasulikud tegemaks uuritavast geenist kergesti hallatavaid koopiaid ja tootmaks selle põhjal vajaminevat valku. Sangeri sekveneerimise põhimõte. Kasutatakse didesoksüribonukleotiide, mis erinevad desoksüribonukleotiididest selle
sama) DNA järjestusi ja on võimelised neid kindlas piirkonnas kindlas suuruses (tüüpiliselt 4-8 kb pikk) lõikama, tekitades ülekattuvate otstega fragmente, mis on samaaegselt identsed ja kompelmentaarsed, et saaks komplementaarselt paarduda. Lõigatud DNA fragmente saab sisestada sarnaselt lõigatud vektorisse, mis kannab replikatsioon origini, et rakus iseseisvalt replitseeruda. Saadakse hübriid-DNA molekulid ehk rekombinantsed DNA molekulid, mis transformeeritakse sobivasse peremeesrakku. Iga peremeesrakk võtab ühe rekombinantse DNA molekuli sisse. Transformeeritud rakud pannakse kasvama ning rekombinandid paljunevad peremehest eraldiseisvalt. Paljunemisega tekivad kloonid ehk identsed rakud. Väljaplaatimisega saab kloonid eraldada ning uuesti kasvamapanemisega saab kloone juurde paljundada. Lõpuks puhastatakse rekombinantne DNA välja. 53. Inimese geenide ekspressioon, cis ja trans mõjuvad
Alusta PCR'i. (5) Samal ajal valmista ...% geel. 40 ml TBE puhvri kohta on vaja kaaluda ... g agaroosi. Valmistamist vaata tööst nr 3. (6) PCRi lõppedes (<1 tund), analüüsi 1/5 saadud produktist agaroosgeelil. Selleks pipeteeri 10 l 1 x TBE foreesipuhvrit (lilla) + 2 l PCR tuubist kokku 12 l, kanda kõik geelile. Geelile lisada kindlasti molekulmassi marker ja kontroll PCR (amplifikatsioon tühjalt pBS SK+ plasmiidilt). Interpreteeri tulemus. Saadud rekombinantsed plasmiidid on valmis inserdi sekveneerimiseks T7 praimeri ja "kit"i abil (järgmises praktikumis). Restriktsiooni tulemused: Minu minipreparatsioonis tuli välja 2 inserti. Üks umbes 2,5 kb pikkune ja teine umbes 6 kb pikkune. Võib olla see on tingitud sellega, et ensüüm Cfr421 ei töötanud väga hästi. 10 Lisaülesanded: 4.1) Leia Wallace reegli abil (4x GC + 2x AT) T3 ja T7 praimerite sulamistemperatuurid. Kui
pärilikkusainet. Homoloogilised kromosoomid vahetavad vastastikku samade õlgade või samapikkusi osi (tavaliselt). Ristsiirde tulemusena kromosoomide arv ja kuju tavaliselt ei muutu. TÄHTSUS tekivad geenikombinatsioonid isalt ja emalt pärinevad geenid jagunevad homoloogiliste kromosoomide vahel ümber, mis suurendab pärilikku muutlikkust. Lisaks moodustab materjali loodusliku valiku jaoks populatsioonides, tekivad rekombinantsed isendid (geenivahetuse tagajärel) 15. Mis on eukarüoot? Eukarüoodid ehk päristuumsed (Eukaryota) on organismid, kelle rakud on päristuumset (eukarüootset) tüüpi. Eukarüoodid on oma nime saanud selle järgi, et neil asub geneetiline informatsioon (kromosoomidena) rakutuumas, mis on membraaniga ümbritsetud organell. Eukarüootsed geenid on katkendliku struktuuriga. Nad koosnevad eksonidest kodeerivatest lõikudest ja
kromosoomi kohta geneetilisi kaarte. Morgani katsed kärbestega: Mittevanemlikud genotüübid on rekombinandid Sõltumatu jaotumise korral on eeldatavalt rekombinante 50% Morgani katsetes oli see 900/2,441 (36.9%) rekombinantseid fenotüüpe, millest ta järeldas, et need lookused peavad olema aheldunud Morgani seaduspärasused (tema poolt veel hüpoteesid) 1. Vanemfenotüübid on alati sagedasemad kui rekombinantsed 2. Geenid asuvad kromosoomis alati lineaarselt ja homoloogides on samu tunnuseid määravad alleelid samas kohas ehk lookuses 3. Meioosi käigus osa geene läheb gameetidesse üheskoos, kuna nad on samas kromosoomis ja üksteisele suhteliselt lähedal 4. Mida lähemal geenid kromosoomis asuvad, seda vähem on nende geenide osas rekombinante 5. Rekombinandid moodustuvad ristsiirde tulemusena
· palju järglasi · selgelt avalduvad tunnused. · Äädikakärbse geenid on kaardistatud · Ta on bioloogiliselt üks läbiuurituimaid organisme. Geenivahetuse olemus ja tähtsus : · toimub meioosi esimeses profaasis · homoloogilised kromosoomid vahetavad vastastikku osasid · toimub DNA molekulide katkemine ja osade vahetus - tekivad uued geenikombinatsioonid - tagatakse pärilik muutlikkus - moodustub materjal loodusliku valiku jaoks populatsioonides - tekivad REKOMBINANTSED ISENDID(geenivahetuse tagajärjel moodustunud isendid) Aheldunud pärandumise olemus ja tähtsus : - põhineb faktil, et ühes kromosoomis lähestikku asuvad geenid päranduvad koos. - Tagab selle, et evolutsioonis ennast õigusatnud geenikombinatsioonid jäävad muutumatuks. - Välditakse kõikvõimalike kahjulike geenikombinatsioonide teket. - Sarnase toimega geenid(geeniperekonnad) paksid päranduma koos.
Selle süntees on oluline etapp eukarüootsete geenide kloonimisel. 43. Millised on kloneeritud DNAde kasutusalad tänapäeval? 1. Saab uurida mingi geeni tegelikku funktsiooni e saab näha, millised muudatused kutsutakse rakus esile, kui sisseviidud geeni pealt hakatakse sünteesima valku. 2. Rakendusliku poole pealt on võimalik panna rakke sünteesima kloonitud geeni poolt kodeeritud valku tööstuslikel/kliinilistel eesmärkidel. Nt. kasutusel rekombinantsed DNA molekulid, kuhu kloonitud insuliini geen. Selline DNA viiakse laboritingimustes kasvavatesse rakkudesse, kus algab insuliini süntees. Sünteesitud insuliin on võimalik välja puhastada ja seda kasutatakse diabeedi ravis. 44. DNA sekveneerimise põhimõte Ehk järjestusanalüüs on monomeeride järjestuse kindlasmääramine informatsiooniliste biopolümeeride (DNA, RNA, valkude) molekulides. 45. Polümeraasi ahelreaktsioon
Nii tuleks nad kaardil paigutada teineteisest 50 cM kaugusele. Tänu nende kahe geeni vahele jäävate geenide vaheliste distantside summeerimisele saame distantsiks 66,8 cM. Seega võib tõeline geneetiline distants kahe geeni vahel olla teoreetilisest suurem. Suuremate vahemaade puhul võib toimuda kahe kromatiidi vahel topeltristsiire, nii et lõpptulemusena taastub algne olukord. Sama efekti annab ka neljakordne ristsiire. Kuna sel juhul ei ole kromosoomid rekombinantsed, jäävad need sündmused arvutustest välja. Kokkuvõtvalt võib öelda, et geenidevaheline rekombinatsiooni sagedus, mis jääb allapoole 20 25%, kajastab nendevahelist distantsi täpselt, üle selle ilmnevad kõrvalekalded tegelikust olukorrast tegelik vahemaa on teoreetilisest pikem, kuna osa mitmekordseid ristsiirdeid ei vii lõpptulemusena rekombinantsete kromosoomide moodustumisele ja jäävad arvutustest välja. 6.4. Kiasmide sagedus ja geneetiline distants
Passiivne immuniseerimise korral, ei kutsuta esile immuunsüsteemi aktivatsiooni ja ei teki immunoloogilist mälu, kaitse on lühiajaline ja ajutine. Selleks on näiteks mao hammustuste korral anav vaktsiin. Viiakse sisse puhastatud mürgiga seonduvaid antikehi. Kahjustatud e. atenueeritud elusvaksiinid ning inaktiveeritud/surmatud vaksiinid on olnud enimlevinud viirusvaksiinid ja bakteriaalsed vaksiinid. Võivad olla veel puhastatud mikroobsetest komponentidest vaksiinid, rekombinantsed vaksiinid (vaksiinis rakendatakse tõvestaja komponente, mida toodetakse teistes organismides, milliseid on laborioludes kerge kasvatada; neid saab suures koguses; tekitavad põhiliselt humoraalse im vastuse), DNA vaksiinid ja viiruse sarnastel partiklitel jt kandjatel põhinevad vaksiinid. Atenueeritud elusvaksiinid kasutatakse nõrgestatud tõvestavaid mikroobe, mis pole võimelised haigust põhjustama, aga suudavad organismis tekitada tugeva B- ja T-rakulise immuunvastuse
S. cerevisiae kasutamine ristsiirete uurimisel. Elutsükkel: 1 rakuline haploidne organism paljuneb pungumise teel. Sugulisel paljunemisel liituvad kaks erineva ristumistüübiga rakku. Diploidne rakk läbib meioosi, tekib 4 haploidset askospoori, mis jäävad kokku askusesse. Haploidsed pärmirakud. Laboris kultiveeritakse tardsöötmel. Katsed pagaripärmiga tõendasid, et iga ristsiirde toimumise tagajärjel on neljast kromatiidist 2 rekombinantsed. Üks rekombinatsioonisündmus tekitab askuses 2 rekombinantset ja 2 mitterekombinantset askospoori. Järelikult toimub ristsiire pärast seda, kui homoloogilised kromosoomid on duplitseerinud. 34. Mida näitavad homoloogiliste kromosoomide vahelised kiasmid? Kiasmid homoloogiliste kromosoomide paardumisel tekkinud ühendused. Nad näitavad ristsiirete toimumiste kohti ja arve iga homoloogiliste kromosoomide
RK toimub väiksema tõenäosusega kromosoomi otste lähedal ning tsentromeeri piirkonnas geneetilisel kaardil on need alad kokku surutud. Ülejäänud regioonid, kus RS toimumise tõenäosus on kõrgem, on geneetilisel kaardil välja venitatud. 33. Pagaripärmi Saccharomyces cerevisiae elutsükkel. S. cerevisiae kasutamine ristsiirete uurimisel. Katsed pagaripärmiga tõendasid, et iga ristsiirde toimumise tagajärjel on neljast kromatiidist kaks rekombinantsed. Elutsükkel: Vahelduvad haploidne ja diploidne elustaadium. Ührakuline haploidne organism paljuneb pungumise teel; need rakud saavad võrdselt geneetilist infot. Iga rakk võib olla aluseks kolooniale. Haploidsed rakud võivad omavahel liituda e toimub rakkude ristumine, mille tulemusena saadakse diploidne rakk. See läbib meioosi, mille tulemusena tekib 4 haploidset askospoori, mis jäävad kokku askusesse (ühe rekombin tulemusena
nukleotiidijärjestusega restrikaaside äratundmissaidid ning põhjustavad nendes kohtades DNA- molekuli katkilõikamist, äratundmissaidis on palindroomne DNA- järjestus. Võib saada tömpide otstega DNA lõigud, kui mõlemas DNA- ahelas põhjustatakse katked samas DNA puntkis või kleepuvate otstega DNA lõigus, kui katkemised toimuvad erinevates ahelates teineteise suhtes nihkes, DNA ligaas sünteesib nende vahele fosfordiestersideme, moodustuvad rekombinantsed DNA- molekulid. 41. DNA kloneerimise etapid. Et töötada spetsiifiliste geenidega, tehakse DNA-st `geeni-suurused' koopiad niisugune DNA molekulide/molekuli osade kopeerimine ongi DNA kloneerimine. DNA kloonimiseks kasutatakse kõige enam baktereid ja plasmiide. Plasmiidid on väiksed rõngasjad bakteriaalsed DNA molekulid, mis replitseeruvad bakterikromosoomist eraldi. Etapid:
Seetõttu kasutati vaktsiinis keemiliselt muudetud toksiini, mis oli kaotanud oma toksilised omadused. Saadi suurepärased tõhusad ja ohutud vaktsiinid, mis on kasutusel siiani. Puhastatud ühekomponendilise vaktsiini puhul toimub immuunstimulatsioon eelkõige kaitset pakkuvatele molekulidele, kuid tavaliselt on see B-rakuline immuunvastus ja kaitse võib jääda nõrgaks, seepärast kasutatakse liitvalke: N.polüsahhariid+ valguline AG. · REKOMBINANTSED VAKTSIINID - Suureks probleemiks uute vaktsiinide saamisel on mikroobid, mis ei kasva laborioludes. N: B ja C hepatiidi viirused; pidaltõbi, hingamisteede nakkus, malaaria. Läbimurre selliste mikroobide vastaste vaktsiinide valmistamisel tuli tehnoloogiaga, kus haigust tekitavate mikroorganismide geenid kantakse üle ja ekspresseeritakse tehistingimustes - kergesti kasvatavates organismides (E.coli) Esimeseks oli B-hepatiidi vaktsiin, see ekspresseeriti pagaripärmis.
toimumist. I tase: I=1-c. I tase on geneetilise kaardi vahemikus vaiksem kui 20cM 69. Kuidas määrata geenide asukohta aheldusgrupis? Geenide kaardistamine. Geenide asukohta maaratakse geneetilise analüüsi phjal. Üks voimalus on tetraadi analüüs: selleks, et leida geneetilist vahemaad geenide vahel, saab kasutada jargmist valemit:[1/2T+NPD]/total, kus T - tetratüüp, NPD - mittevanemtüübi ditüüp. T jagame kahega, sest vaid pooled kromatiidid on tetraadis geneetiliselt rekombinantsed. Arvestades ka 3-ahelalisi 2xkrossingovereid, siis tetraadide vahetuste arv kromatiidi kohta - ¾. Teine voimalus kasutada markergeene. Uuritav mutatsioon ei saa avalduda koos dominantse markergeeniga. Kui uuritav geen annab suguliitelise lahknemise, siis ta on X kromosoomis. Saab labi viia ka sugupuuanalüüsi voi saab asukoha määrata somaatiliste rakkude hübridiseerumise abil (hiir + inimene).Hübriidi rakud kasvatatakse HAT söötmel, toimub HPRT+ ja TK+ rakkude selektsioon
eksotsütoos (olemasolevate mediaatorite vabastamine: NCF, ECFA – kemotaktilised faktorid; histamiin, serotoniin; trüptaas (→C3), kininogennas (→kiniin)) uute ainete süntees: leukotrieenid (LTD4, LTC4), prostaglandiinid (PGD2, PGE2, PGI2), PAF (trombots. aktiveeriv faktor) 54. IgG4 ja allergia. 55. Allergia in vivo ja in vitro testide üldine iseloomustus. Üld-IgE ja spetsiifilise IgE määramise kliiniline tähendus. Rekombinantsed allergeenid - uued võimalused täpsemaks diagnostikaks ja raviks. Allergia in vivo ja in vitro testide üldine iseloomustus. Testide eesmärk on põhjusliku allergeeni väljaselgitamine ja etioloogilise diagnoosi kinnitamine. Samuti on testid vajalikud ravitaktika valikuks nt. konkreetse allegreeni vältimiseks ja spetsiifilise immuunravi määramiseks. Allergiat identifitseerivaid teste on vähe ja nende kasutamine on piiratud kliinistes laboratooriumides.
· odav pidada · palju järglasi · selgelt avalduvad tunnused. · Äädikakärbse geenid on kaardistatud · Ta on bioloogiliselt üks läbiuurituimaid organisme. Geenivahetuse olemus ja tähtsus : · toimub meioosi esimeses profaasis · homoloogilised kromosoomid vahetavad vastastikku osasid · toimub DNA molekulide katkemine ja osade vahetus - tekivad uued geenikombinatsioonid - tagatakse pärilik muutlikkus - moodustub materjal loodusliku valiku jaoks populatsioonides - tekivad REKOMBINANTSED ISENDID(geenivahetuse tagajärjel moodustunud isendid) Aheldunud pärandumise olemus ja tähtsus : - põhineb faktil, et ühes kromosoomis lähestikku asuvad geenid päranduvad koos. - Tagab selle, et evolutsioonis ennast õigusatnud geenikombinatsioonid jäävad muutumatuks. - Välditakse kõikvõimalike kahjulike geenikombinatsioonide teket. - Sarnase toimega geenid(geeniperekonnad) paksid päranduma koos. Muutlikkus : - organismide (sama liigi) võime üksteisest erineda.
pikkusega restriktsioonifragmendid. Restriktsioonifragmentide pikkuse polümorfismi RFLP-d on võimalik detekteerida näiteks "Southern blot" analüüsil. DNA restrikteeritakse, fragmendid lahutatakse geelelektroforeesil, kantakse filtrile ja hübridiseeritakse spetsiifilise radioaktiivse DNA prooviga. RFLP-d kasutatakse geneetilise markerina kromosoomide kaardistamisel. Samuti võimaldab RFLP analüüs hinnata, kas ristamisel saadud järglased on vanemtüüpi või rekombinantsed. juhul, kui on tegemist rekombinantidega, saab rekombinatsioonisageduse põhjal arvutada RFLP-de geneetilist distantsi. Sellist analüüsi on rakendatud näiteks taime Arabidopsis geneetilistes katsetes. RFLP markereid kasutatakse ka inimese kromosoomide kaardistamisel. Sel juhul on vaadeldud näiteks markerite segregeerumist suguvõsas. Markerite aheldumise alusel on koostatud kaardid. Nii esitati 1992. aastal esimene inimese kromosoomide RFLP-de kaart, mis baseerus 2000-l RFLP-l.
järjestuse määramiseks krossingoveri alusel. Krossingoveri sageduse alusel koostatakse erinevate loomaliikide kromosoomikaardid, kus määratakse ära teadaolevate geenide suhteline järjestus aheldusrühmas (kromosoomis). Krossingoveri olemasolu on tõestatud ka põllumajandusloomadel. Näiteks käharsuliste kukkede ja valgete normaalsuliste kanade ristamisel olid 80,3% järglastest vanematega sarnased, kuid 19,7% olid rekombinantsed (valged käharsulised ja mustad normaalsulised). Retsiprooksel ristamisel, vastupidiselt, nüüd kuked valged normaalsulised ja kanad mustad käharsulised, saadi rekombinante peaaegu sama palju 18,2%. See tõestab, et ristsiire esineb mõlemal sugupoolel võrdse sagedusega. Ristsiirde sagedus näitab ahelduse püsivust lookuste vahel. Kui rekombinante moodustub vähem, on lookused tugevamini aheldunud ja vastupidi. Geenidevahelise kauguse mõõtühikuks on morgan
siirdamises sama või muu liigi isendi geneetilisse struktuuri- kromosoomi, plasmiidi või viirusesse. Rekombinantseks DNA-ks nimetatakse DNA molekuli, milles on ühendatud eri liikidelt pärit DNA-fragmendid. Restrikaasid on testriktsiooniensüümid- need on omapärased ensüümid, mis lõikavad DNA molekuli kaksikahelat kindlate järjestuste kohalt. Ensüüm ligaasi toimel ühinevad ahelate otsad kovalentsete sidemetega ja rekombinantsed molekulid ongi moodustunud. Kleepuvate otste kasutamine Kahe erineva DNA töötlemisel tekivad identsed „otsad“. Komplementaarsuse alusel paadudes saab need kokku kleepida. Kleepimiseks on vajalikud ensüümid- ligaas. Transgeensed organismid Ehk GMO-d (geneetiliselt muundatud organismid). Transgeensed- organismi on viidud teise liigi geene, mis avalduvad ja päranduvad järglastele. Avaldub uus, mõnele teisele liigile omane tunnus
statsionaarsesse faasi. Enamiku ensüümkatalüüsitavate reaktsioonide puhul tähendab see seda, et reakt tuleb jälgida millisekundite ajaskaalas, selleks vaja kasutada eri aparatuuri, mis võimaldab kiiresti kokku segada ensüümi ja substraadi ja kiiresti detekteerida produkte. Peab kasutama kõrgeid ensüümi kontsentratsioone ensüüm peab olema mitte katalüsaatori, vaid reagendi kontsentratsioonis. Kui tahame natiivsest organismist välja puhastada ensüüme (mitte rekombinantsed jne), siis need esinevad väikestest hulkades, puhastamine mõistliku koguse saamiseks on väga suur töö. (Mõnda ensüümi on 10-20 koopiat raku kohta). Ensüümi konts peab olema kõrge, sest tahame jälgida erinevaid vaheühendeid ntx ensüüm-substraat kompleksi, seda konts aga ei saa olla suurem, kui on ensüümi kogukonts. Me peame aga saama piisavalt hea signaali, seetõttu peab konts olema piisavalt kõrge.
Lõigatakse lahti need, kus tekitati katkestused. Sellest sõltub aga tulemus, sest ühel juhul tekib rekombinantne tulemus, teisel juhul vana olukord tagasi. Need alleelid, mis enne olid erinevates molekulides, on nüüd samas molekulis. ’-dega ahelad vahetavad omavahel kohti. Holliday mudel 82 See on mudel, mis ei peegelda tegelikkust, vaid iseloomustab toimuvat reaktsiooni. Ei põhine katsetel, vaid sellel, et rekombineerumise tulemusel tekivad rekombinantsed DNA molekulid. Esinevad kaks kaheahelalist ahelat – komplementaarne ja teine alleel. Ahelad, mis tähistatud erinevalt, sisaldavad samu geene. Tehakse üheahelalised katked ja nad (sama alleel) vahetab ahelaid. Omavahel vahetavad nii, et tekiks komplementaarne DNA. Kui ahelad vahetatakse, tekib ühendus. Teine ahel ikka samamoodi koos. Ahela ühendus liigub ja liikumise käigus aluspaarid ühelt poolt sulavad, teiselt poolt tekivad tagasi. Energeetiline efekt on väike
annaabi.ee 
