kontsentratsiooni ühtlustamiseks väliskeskkonnast vett ja paisuvad. Kuna profaasis on tuumamembraan lagunenud ja mitoosi kääv tänu kolhitsiinile depolümeriseerunud, siis saavad kromosoomid paisuvas rakus vabalt liikuda. Fikseerimine. Rakke fikseeritakse metanooli ja jää-äädikhappe segus vahekorras 3:1. Metanool denatureerib ja sadestab valgu, äädikhape aga koaguleerib nukleoproteiini. Kromosoomipreparaadi tegemine. Preparaadi valmistamisel tilgutatakse fikseeritud rakususpensioon puhastatud märjale alusklaasile ning kuivatatakse kas õhus või leegil. Niiskes keskkonnas on kromosoomid pehmed, kuid muutuvad kõvaks kohe peale kuivamist. Pehmed kromosoomid on väga elastsed, eriti kui neid on väga lühikest aega fikseeritud. Elastseid kromosoome on võimalik faaskontrastmikroskoobi all mitu korda pikemaks venitada nagu kummipaela. Niiskes keskkonnas läbi viidud kromosoomide pikendamist nimetatakse kromosoomide venitamiseks ehk
7. Rakkudelt imeda vaakumiga sööde, pesta 1 ml PBSiga , PBS ära imeda. 8. Lisada trüpsiin-EDTA lahust 0,2 ml, inkubeerida mitte rohkem kui 5min. 9. Lisada 1ml söödet (DMEM + 10% FBS NB! antibiootikumideta), suspendeeri rakud 1ml automaatpipetiga tassi küljest lahti. 10. Teha söötmega sobiv lahjendus, et rakkude lõpptihedus 24-augulisel plaadil oleks 33,3%. Arvestada 0,5 ml rakususpensiooni augu kohta. Selleks võtta 40 µl rakususpensiooni ja 410 µl söödet augu kohta. 11. Pipeteeri rakususpensioon klaasidel olevatele transfektsioonisegudele, loksuta. 12. Aseta rakud inkubaatorisse: 37°C, 5% CO2 13. 2-4h möödudes pesta rakke 1xPBS-ga ja lisada rakkudele värske sööde (nüüd võib sisaldada ka antibiootikume). Tavaliselt rakkude transfekteerimisel nad külvatakse, lastakse paraja tiheduseni (30-70%) kasvada ja transfektsioonisegud lisatakse kinnitunud rakkudele. Meie kasutame vastupidist tehnikat aja kokkuhoiu huvides. c
Meie rakkude algne tihedus oli 95%. tiheduste suhe: 95/30 = 3,16x pindalade suhe: 21/1,9 = 11,05x lahjendus: 3,16 ∙ 11,05 = 34,92x 1200 μl / 34,92 x = 34,36 μl rakke 133. 1 welli kohta võtame 500 μl, seega 2 welli kohta (+10%) 1100 μl rakususpensiooni. 1100 μl – 2,2 ∙ 34,36 μl = 1100 μl (kokku) – 75,59 μl (rakud) = 1024,41 μl (sööde) 6. Pipeteerida rakususpensioon klaasidel olevatele transfektsioonisegudele, loksutada. Asetada rakud CO2 inkubaatorisse. Söötme vahetus 2-4 h möödudes on vajalik ainult tudlike rakuliinide puhul. 134. Teine päev – mikroskoopia 135. Kahjuks, üks meie wellist (mis ei sisaldanud FoxO3a-d) oli saastanud ja suspensiooni värv muutus kollaseks ning lahus ise muutus hägusaks. Värvuse muutus tähendab keskkonna pH muutumine happelisemaks bakterite elutegevuste käigus. 136
• pindalate suhe (6cm plaat vs 24 auguline plaat): 21cm2/1,9cm2 = 11,05x • lahjendus: 3 ∙ 11,05 = 33,15x • 1200 μl / 33,15 x = 36,20 μl rakke 1 welli kohta võtame 500 μl, seega kohta welli kohta (+10%) 2 ∙ 500μl ∙ 110%=1100 μl rakususpensiooni. • 1100 μl – 2,2 ∙ 33,15 μl = 1100 μl – 72,93 μl (rakud) = 1027,10 μl (sööde) Pipeteerisin rakususpensioon klaasidel olevatele transfektsioonisegudele, loksutasin. Panin rakud CO2 inkubaatorisse 37°C, 5% CO2. Teine päev – mikroskoopia Mõlemates wellides suspensioon oli punase värvi, seega pH on rakkudele paras, seega saastus ei olnud, vaatamata sellele, et antibiootikum pole olnud lisatud. Saab järjledada, et aseptika oli jälgitud. Selleks, et teha kindlaks, et meie plasmiid on raku sees on vaja kasutada Fluorestsentsmikroskoobi
annaabi.ee 
