koguste antibiootikumidega, kust satuvad need pinnasesse, veekogudesse jne) “Mis antibiootikume võttes sinuga tegelikult toimub?” https://www.telegram.ee/toit-ja-tervis/mis-antibiootikume-vottes-sinuga-tegelikult-toimub Biotehnoloogia Inimesele vajaliku tootmine (ained: ensüümid, vaktsiinid, antibiootikumid või keskkonnareostuse likvideerimine) elusorganismide abil (bakterid, pärm- või hallitusseened, putuka- ja imetajate rakukultuur: hamster) Biotehnoloogia plussid: - Odav tooraine, kuna mikroorganismid söövad vähe (kasutatakse ka ülejääke) - Keskkonnale kahjutud jäätmed, kuna organismid väiksed - Kulutatakse vähe energiat Biotehnoloogia miinused: - Vajalike mikroorganismide tekitamine on aeganõudev ja kallis (geenitehnoloogia insenerid laborites) Biotehnoloogia ajaloolised kasutusalad: - Hapendamine (piimhappebakterid) → piimatooted, erinevad köögiviljad (kurk jms)
koguste antibiootikumidega, kust satuvad need pinnasesse, veekogudesse jne) “Mis antibiootikume võttes sinuga tegelikult toimub?” https://www.telegram.ee/toit-ja-tervis/mis-antibiootikume-vottes-sinuga-tegelikult-toimub Biotehnoloogia Inimesele vajaliku tootmine (ained: ensüümid, vaktsiinid, antibiootikumid või keskkonnareostuse likvideerimine) elusorganismide abil (bakterid, pärm- või hallitusseened, putuka- ja imetajate rakukultuur: hamster) Biotehnoloogia plussid: - Odav tooraine, kuna mikroorganismid söövad vähe (kasutatakse ka ülejääke) - Keskkonnale kahjutud jäätmed, kuna organismid väiksed - Kulutatakse vähe energiat Biotehnoloogia miinused: - Vajalike mikroorganismide tekitamine on aeganõudev ja kallis (geenitehnoloogia insenerid laborites) Biotehnoloogia ajaloolised kasutusalad: - Hapendamine (piimhappebakterid) → piimatooted, erinevad köögiviljad (kurk jms)
elusorganismil esineb, rakul ei esine. · Areng selles suunas, et asendada loomkatseid. · Praktika näitab, et in vitro katsed ei asenda kaugeltki veel loomkatseid ravimite ja teiste keemiliste ainete ohutust ei osata veel piisavalt hinnata in vitro katsete abil Mida määratakse rakukultuuride puhul · Rakkude suremust · Üldvalgu hulka · Mingi ensüümi aktiivsust · Bioluminestsentsi PLHC-1 rakukultuur EROD activity 16 14 South pmol/min/mg prot 12 Middle 10 North 8 6 4 2 0 5 10 20 30 40 50 60 70 Extract from dry sediment (mg per ml medium)
rakuliinid surematud st. paljunevad piiramatu arv kordi, kuid peab siiski arvestama asjaoluga, et aja jooksul rakud siiski muutuvad. Pärinevad reeglina embrüonaalsetest või kasvajalistest kudedest. Tavaliselt ostetakse rakupangast (ATCC, DSMZ) ja paljundatakse ise edasi. Tuntumad rakuliinid HeLa inimese emakakaela kartsinoomist; HEK293 inimese embrüonaalsed neerurakud; Cos7 rohepärdiku neerurakud; NIH3T3 hiire embrüonaalsed fibroblastid; ... Primaarne rakukultuur on otseselt koest eraldatud rakkudest koosnev ja piiratud jagunemisvõimega kloon. Rakuliin on imortaliseeritud kloon, mis on võimeline paljunema/ jagunema piiramatult. Immortaliseeritud liine saab kas iseeneslike mutatsiooni tagajärjeliste transformatsioonide kaudu, ka eraldades rakke kasvajatest. Tekitada kunstlikult telomeraasi sisseviimisel rakku. Rakuliin sageli aneupolidne- kromosoomide arv normaalsest erinev (tavaliselt suurem). Eri rakutüübid
Fusiooniproteiin tekitabki süntsüütiume. 2. Kanaembrüo – nakatame allanotoisiõõnde. Gripiviiruste puhul 5% erütrotsüütide suspensioon + allantoisivedelik – sadenemine – järelikult hemaglutiniin olemas. 3. Katseloom – tekivad immunoglobuliinid – uuritakse seroloogiliselt ehk määratakse antikehad ja tiiter. 18. Seroloogilised meetodid viirushaiguste diagnoosimiseks neutralisatsioonireaktsioon – NR – tehakse elusrakus (rakukultuur, embrüo, katseloom), et määrata antikehade olemasolu, tiiter (antikehad seerumis) või viiruse tiiter. Võetakse haiguse alguses proov ja 2n pärast uus proov. 1. meil on seerum – tahame teada, kas on antikeha?Antikehi tiitrime 2x. 2. teeme 2x lahjendused: 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 – mida suurem tiiter, seda vähem antikehi. Nt veiste viirusdiarröa – lisame antigeeni igale seerumi lahjendusele. nt 100 ühikut viirust. 3. Selle seerum-viirus suspensiooni lisame nüüd rakkudele:
Kordamisküsimused 1.prax: · Mis on rakuliin ja rakkude primaarkultuur, mille poolest erinevad? Primaarne rakukultuur on otseselt koest eraldatud rakkudest koosnev ja piiratud jagunemisvõimega kloon. Rakuliin on imortaliseeritud kloon, mis on võimeline paljunema/ jagunema piiramatult. Immortaliseeritud liine saab kas iseeneslike mutatsiooni tagajärjeliste transformatsioonide kaudu, ka eraldades rakke kasvajatest. Tekitada kunstlikult telomeraasi sisseviimisel rakku. Rakuliin sageli aneupolidne- kromosoomide arv normaalsest erinev (tavaliselt suurem). Eri rakutüübid
RNA genoom. Molekulaarsete funktsioonide ja kodeeritud valkude homoloogiate järgi kuulub HEV virus alfa-sarnaste viiruste hulka. ORF3 kodeerib fosfoproteiini, mis seondub raku tsütoskeletiga ja mõjutab signaalülekande radade kaudu peremeesraku geeniekspressiooni. Organismis (inimene, primaadid) replitseerub HEV maksakoes. Praegusel ajal puuduv HEV replikatsiooni uurimiseks sobiv rakukultuur (replitseerub ainult ahvide primaarsetes hepatotsüütides). Tobamoviirused- tubaka mosaiigiviirus (TMV) Alfa-sarnaste taimeviiruste ühised jooned on: Genoomide 5’-otstes asub cap-struktuur, mis sünteesitakse viiruse ensüümide poolt. Vähemalt osade geenide ekspresiooniks kasutatakse sgRNA-sid, mis sünteesitakse kasutades subgenoomset promootorit, negatiivse RNA maatritsil. TMV virion
Kile viiakse sondi sisaldavasse lahusesse. Sond hübridiseerub vastava üksikahelise DNA fragmendiga ja tema asukoht elektroforegrammil on vôimalik kindlaks määrata, kuna sond on märgistatud. Northern blotting'iks nimetatakse RNA fragmentide määramist samal meetodil. Kromatograafia valkude puhastamisel. Valkude eraldamine kromatograafiliselt (st puhta või rikastatud valgu eraldamine bioloogilistest materjalist (taimeleht, organell, aju, rakukultuur, bakterimass) ‘’segudest’’’ – nt lüüsitud rakkudest/kudedest) 1. Segu lahustatakse vedelikus - nn ‘’mobiilne faas’’, mis voolutatakse (flow) läbi nn ‘’statsionaarse faasi’’. 2. Segu (mixture) eri koostisosad constituents liiguvad erinevad kiirusega ja nad lahutatakse üksteisest 3. Eraldus põhineb liikuva faasi erinevate koostisosade erinevas ‘’külgejäämises’’ statsionaarsele faasile.
Miinused: mikroob ei tohi transpordi käigus enne kultuuri panemist ära surra; võib siiski osutuda mittespetsiifiliseks (söötmetest sõltuv); aeganõudev (tuberkuloosibakter kasvab 1,5 2 kuud); nõuab samastamist (kasvatame üles, peame veel kinnitama, et on see bakter DNA hübridisatsiooniga); inimest on juba ravima hakatud ja alles siis võetakse proov kasv on pärsitud juba; saastamine transpordil. 3. Biotestid 1. rakukultuur kliiniline proov, millega neid rakke nakatame. Kõige tuntum on klamüüdia diagnostika. Rakukultuuris kasvatatud organism ei tohi olla transpordil või ravi tõttu surnud. 2. Loomkatsed katkupisiku diagnostika. Eetikaküsimus. Loomad on väga kallid. Loomakaitsjad võitlevad selle vastu. 4. Kiirmeetodid (molekulaardiagnostika) 1. nukleiinhapete määramine 2. antigeeni/antikeha määramine antigeen ja antikeha peavad omavahel väga
Kolooniale vajutatakse steriilse, velvettempliga ning see viiakse Petri tassidele, mis sisaldavad erinevaid söötmeid. 5. Loomsed rakukultuurid, nende erinevus mikroorganismide kultuurist. Loomsed rakud vajavad rikastatud söödet: aminohappeid, vitamiine, kasvufaktoreid, insuliini, transferriini. Tavaliselt kasvavad tasapinnal, mis on kaetud spetsiaalse maatriksiga. Selline maatriks on kinnituskohaks ECMile - hüaluroonhape, kollageen ja teised ECM valgud. 6. Defineeri primaarne rakukultuur - saadud loomsetest kudedest; suurem osa loomsest koest eraldatud rakke jaguneb piiratud arv kordi piiratud aja jooksul (keskmiselt 50 jagunemist), pärast seda rakud surevad ja rakuliin - "transformeeritud rakud" jagunevad lõpmatult ja selliseid ühest rakust alguse saanud immortaliseeritud kloone nimetatakse rakuliiniks. Rakuliinid sageli aneuploidsed - kromosoomide arv erinev normaalsest. Rakuliinid pole tavaliselt diferentsieerunud, osadel siiski algse koe funktsioonid. 7
Võib areneda bronhopneumoonia. Haiguse arenedes tekib köha. Healoomulise kulu korral kaovad haigustunnused 6.- 14 päeval ja loomad tervistuvad. Tüsistuste korral tekib tugev valulik köha, ninaeritis muutub tihkeks ja venivaks, loom kõhnub ning karvkate tuhmub. Levik: levib karjas kiiresti, kui on loomi, kes pole sellega varem kokku puutunud. Levib otsese või kaudse kontaktiga. Diagnoosimine: Uurimiseks võtta noreproovid, äiged. Nakatada rakukultuur. Isoleerimine on kergem, kui proovid on võetud loomalt, kes on inkubatsiooniperioodis või akuutses faasis. See on RNA-viirus, mis paljuneb tsütoplasmas. Immuunofluoresentsiga on tsütoplasmas näha helendavad kogumikud. Rakud ei lüüsu, vaid tekivad süntsüütiumid. Paramyxoviridae -> Alamsugukond – Avulavirus -> Newcastle’i haiguse viirus (lindude paramüksoviirus-1) -> Newcastle’i haigus ehk lindude Aasia katk
Inkubatsioon ilmselt 48 tundi: oksendamine, diarröa, palavik, dehüdratatsioon. Roojas leukotsüüte ega verd pole. Haigus iseparanev, paranemine reeglina tüsistusteta. Samas võib olla surmav, kui pt on enne vaegtoitunud ja nüüd rehüdratatsiooni ka ei saa. Diagnostika. • Viiruse antigeeni määramine roojast on valikmeetod. Kasutada võib nii ensüümanalüüse kui lateksteste. • Roojast võib tekitajat otsida ka elektromikroskoopial. • Rakukultuur on keeruline, ebausaldusväärne. • Seroloogiat kasutatakse peamiselt epidemioloogilistel eesmärkidel, diagnostikaks vaja 4-kordset tiitri tõusu. Ravi ja profülaktika. • Üleüldise esinemise tõttu viiruse levikut ja infitseerumist piirata ei saa. Hospitaliseeritud patsiendid tuleks aga isoleerida. • Spetsiifiline viirusvastane ravi puudub, suremus ja surevus tulenevad dehüdratatsioonist ja elektrolüütide ja happe-leelis- tasakaalu häiretest.
· antibiootikumid · Konfluentne (samasuunaline, koos kulgev) kultuur · Osad kasvavad ka suspensioonis ja 3D-geelis Rakkude kasvatamiseks on vaja: · Tagada kontrollitud keskkond (inkubaatorkapid) · Tagada steriilsus (vertikaalne laminaarne õhuvool) · Tagada töötaja turvalisus patogeensete mikroorganismide või rakukultuuride korral (horisontaalne õhukardin) · Steriilsed töövahendid 6. Defineeri primaarne rakukultuur ja rakuliin. · Primaarsed rakukultuurid on saadud loomsetest kudedest · Suurem osa loomsest koest eraldatud rakke jaguneb piiratud kordi piiratud aja jooksul (keskmiselt 50 jagunemist), pärast seda rakud surevad · Nn. "transformeeritud rakud" jagunevad lõpmatult ja selliseid ühest rakust alguse saanud immortaliseeritud kloone nimetatakse rakuliiniks · Rakuliinid sageli aneuploidsed- kromosoomide arv erinev normaalsest
• Intraabdominaalsed infektsioonid perforatsioonijärgselt. Diagnostika. Söötmetel kasvavad kiiresti. Soolepatogeene määratakse ainult referents- ja uurimislaborites, erand on EHEC. EHECi kasvatatakse MacConkeyl ja siis tehakse kolooniatest immuunmeetodil toksiini produktsiooni kohta test. Toksiini otsene määramine roojast on liiga kallis. EHEC: kultuur, serogrupid, latekstest O157 vastu, PCR EIEC: ELISA, DNA EAEC: koekultuur, DNA EPEC: kultuur, seroloogia, ELISA, DNA, rakukultuur ETEC: latekstestid, ELISA, PCR Ravi ja profülaktika. Soolepatogeenne ravitakse sümptomaatiliselt, kui süsteemset infektsiooni ei esine. EHEC vajab varases staadiumis antibiootikumravi. EIEC ka. Antibiootikumravi kasutamiseks on vaja määrata tundlikkus. Antibiootikumravi võib fakultatiivselt kasutada ka EAECi, EPECi, ETECi puhul. Kinoloonid näiteks. Moraal: määra tundlikkus ja ravi. TMP-SMX oleks vahva, kinoloonid, aminoglükosiidid (gentat monoteraapiana ei kasuta – resistentsus).
näljutamine. Sporulatsiooni indutseerivad ekstratsellulaarsed faktorid, mida produtseerivad hilises eksponentsiaalses faasis sporuleeruma hakkavad rakud. Kui viia rakud hõredast rakukultuurist tiheda rakukultuuri filtraati, hakkavad ka need sporuleeruma. Seega ilmneb sporuleerumisel "quorum sensing" e. hulgatunnetuse efekt. Rakud produtseerivad väliskeskkonda teatud autoinduktormolekule, mis toimivad alates teatavast lävikontsentratsioonist. Mida tihedam on rakukultuur, seda kõrgem on autoinduktori kontsentratsioon. 3. DNA süntees. DNA süntees on obligatoorne emaraku ja spoori kromosoomi tekkeks. Kui DNA süntees inhibeerida, pärsitakse sporulatsiooni varajasel etapil avalduvad geenid. Eelpoolkirjeldatud 3-st signaalist saab alguse fosforüleerimise kaskaad, mis toimub Spo0 signaalse transduktsiooni raja kaudu. See signaali ülekandesüsteem koosneb Spo0A, Spo0F ja Spo0B valkudest. Spo0F on
näljutamine. Sporulatsiooni indutseerivad ekstratsellulaarsed faktorid, mida produtseerivad hilises eksponentsiaalses faasis sporuleeruma hakkavad rakud. Kui viia rakud hõredast rakukultuurist tiheda rakukultuuri filtraati, hakkavad ka need sporuleeruma. Seega ilmneb sporuleerumisel "quorum sensing" e. hulgatunnetuse efekt. Rakud produtseerivad väliskeskkonda teatud autoinduktormolekule, mis toimivad alates teatavast lävikontsentratsioonist. Mida tihedam on rakukultuur, seda kõrgem on autoinduktori kontsentratsioon. 85 3. DNA süntees. DNA süntees on obligatoorne emaraku ja spoori kromosoomi tekkeks. Kui DNA süntees inhibeerida, pärsitakse sporulatsiooni varajasel etapil avalduvad geenid. Eelpoolkirjeldatud 3-st signaalist saab alguse fosforüleerimise kaskaad, mis toimub Spo0 signaalse transduktsiooni raja kaudu. See signaali ülekandesüsteem koosneb Spo0A, Spo0F ja Spo0B valkudest.
Nii paljundati rakkude kasvatamisel 35S sisaldaval söötmel faagi, kus radioaktiivselt olid märgistatud valgud, DNA aga mitte. Kui söötmesse oli lisatud 32P, kuid mitte radioaktiivne väävel, sisaldasid paljunemistsükli läbinud faagipartiklid radioaktiivselt märgistatud DNA-d ja valkudesse radioaktiivsust ei lülitunud. Viidi läbi 2 paralleelkatset: 1) 35S-ga märgistatud T2 partiklitega nakatati E. coli rakke mõne minuti vältel. Seejärel viidi nakatatud rakukultuur segistisse (blender) ning tsentrifuugiti rakud põhja. Enamus radioaktiivsusest jaotus rakupinnalt vabanenud faagi valkude koostises supernatanti. 2) 32P-ga märgistatud T2 partiklite puhul viidi läbi sama protseduur. Sel juhul jäi enamus radioaktiivsust pärast rakkude põhjatsentrifuugimist rakkudesse. Need katsed kinnitasid, et rakkudesse sisenes faagi T2 DNA, mitte aga valguline komponent.
Nii paljundati rakkude kasvatamisel 35S sisaldaval söötmel faagi, kus radioaktiivselt olid märgistatud valgud, DNA aga mitte. Kui söötmesse oli lisatud 32P, kuid mitte radioaktiivne väävel, sisaldasid paljunemistsükli läbinud faagipartiklid radioaktiivselt märgistatud DNA-d ja valkudesse radioaktiivsust ei lülitunud. Viidi läbi 2 paralleelkatset: 1) 35S-ga märgistatud T2 partiklitega nakatati E. coli rakke mõne minuti vältel. Seejärel viidi nakatatud rakukultuur segistisse (blender) ning tsentrifuugiti rakud põhja. Enamus radioaktiivsusest jaotus rakupinnalt vabanenud faagi valkude koostises supernatanti. 2) 32P-ga märgistatud T2 partiklite puhul viidi läbi sama protseduur. Sel juhul jäi enamus radioaktiivsust pärast rakkude põhjatsentrifuugimist rakkudesse. Need katsed kinnitasid, et rakkudesse sisenes faagi T2 DNA, mitte aga valguline komponent.
annaabi.ee 
