Sticky end + lihtsam ligeerida, otsad on komplimentaarsed ja kergesti leiavad teine teist ning ligeeruvad kokku -selle meetodi puhul, pärast restriktaasidega töötlemist, vektor võib kiiresti tagasi kokku ligeerida (lahenduseks defosforüülimine, aga see võib takistada ligeerimist). Mõlemate meetodi puhul võib esineda oht: DNA järjestuse tagasipöördumine. 16. Mis on cDNA? Kirjelda erinevaid meetodeid cDNA sünteesimiseks. Milliseid erinevaid tüüpi praimereid saab kasutada cDNA sünteesis? Kirjelda, mis on cDNA ja genoomse DNA kogum (,,library"). cDNA on DNA, mida sünteesitakse mRNA järgi revertaasi abil (pöördtranskriptaas). cDNA sees on ainult eksonid. cDNA library - kloonide kollektsioon vektorites, mis on saadud RNA-de koopiatest. Ideaalne kogum sisaldab kõiki ühe organismi või koe geeni. DNA kogum: sisaldab ideaalselt vähemalt iga geeni üht koopiat. cDNAd vastavad aktiisetele geenidele, mis kodeerivad valke. Võimaldab
oleme ühest molekulitst saanud juba 1 073 741 824 DNA lõiku. PCR-l vajalikud komponendid: - Uuritav DNA, mille piirkonda soovitakse paljundada - Nukleotiidid – uute DNA ahelate moodustamiseks - DNA-polümeraas – ensüüm, mis sünteesib DNA-d - Praimerid – lühikesed DNA lõigud, mis piiritlevad paljundatava piirkonna kogu DNA-st märgistavad sünteesi alguskoha Erinevaid praimereid saab sünteesida vastavalt soovitavale DNA lõigule. Geel – elektroforees: - DNA proov kantakse geeli “hambasse” koos lahust raskemaks tegeva värvainega - Elektroforeesil liiguvad eri pikkusega DNA järjestused erineva kiirusega, lühemad kiiremini - Võrdluseks liiguvad geelil ka standardsed pikkusmarkerid, mille pikkus, nukleotiidide hulk on teada - Kasutatakse ainult DNA-ahelale seonduvat fluorestseeruvat värvi, mis võimaldab
tootmisele järgnevates etappides. ● Paljundamine toimub eksponentsiaalselt: 2,4,8,16,32,64,128 PCR-i VAJALIKUD KOMPONENDID: ● uuritav DNA, mille piirkonda soovitakse paljundada ● nukleotiidid (kõik 4 erinevat)- uute DNA ahelate moodustamiseks ● praimerid (vasak- ja parempoolne)- lühikesed DNA lõigud, mis piiritlevad paljundatava piirkonna kogu DNA-st, märgistavad sünteesi alguskoha Erinevaid praimereid saab sünteesida vastavalt soovitavale DNA lõigule 6. Isiku molekulaarbioloogiline tuvastamine, DNA sõrmejälgede metoodika. Polümorfsed markerid; Tandem(kordus)järjestus (STR) ja SNP (ühenukleotiidne erisus/varieeruvus). Konspekt + Õp lk 50 - 56. Tuvastamine: vt vihikust STR, SNP jms. DNA sõrmejälgede metoodika- põhineb nähtusel, et iga inimese sõrmejärljed on kordumatud. Genoomis palju muutlikke piirkondi, mida saab eristada fragmentide pikkuse järgi
PCR programm: a. 95 kraadi juures 15 minutit – polümeraasi aktiveerimine b. 95 kraadi juures 10 sekundit – DNA denatureerimine c. 56 kraadi juures 20 sekundit praimerite hübridiseerimine d. 72 kraadi juures 1 minut – ekstensioon e. Korrata alates punktist b. 24 korda. f. 10 minutit 72 kraadi juures, et pikendada poolikuks jäänud PCRi produktid Millist template DNA-d ja praimereid kasutasin? Mille järgi valitakse PCR praimerite hübridiseerimise ehk annealing temperatuur? Milline sulamistemperatuur on praimeril l 5’- GCCATCTCATGCCCATCGC -3’ standardtingimustel ja millist hübridiseerimistemperatuuri kasutaksin? Kuidas need leidsin? Hübridiseerimise temperatuur ja aeg sõltub kasutavate praimerite sulamistemperatuurist, amplifitseeritava DNA konsentratsioonist ja reaktsioonisegu koostisest. Antud järjestuse sulamistemperatuuriks on 59,3
kui uuritakse transkriptoomi ühe raku tasandil? FACSi eelistatakse, kui on vaja väga kõrge kvaliteeti saavutada puhastamisel, kui rakk ekspresseerib väga madalal tasemel uuritavat markerit. 2. Miks kasutatakse UMI-t ning ankurdatud polü-T praimerit? UMI – unique molecular identifier – märgistatud järjestus ja 5’ positsioon mRNAl moodustavad UMI. Ehk UMId märgistavad transkriptid ning võimaldab neid kvantitatiivselt detekteerida. polüT praimereid kasutatakse polüadenüleeritud mRNA pöördtranskriptsiooniks ja cDNA sünteesiks. Sünteesitud cDNA 3’ otsa lisatakse polüA saba terminaalse desoksünukleotidüül transferaasi vahendusel, et varustada cDNA mõlemad otsad universaalse, kuid omavahel erineva ankurjärjestusega. Teise cDNA sünteesiks kasutatakse polüT praimereid, mis kinnituvad polüA pikendusele ja initsieerivad teise cDNA ahela sünteesi. 3
Juhtivahel kopeerub katkematult, mahajääv ahel segmentide kaupa (Okazaki fragmendid), mis seejärel ühendatakse. 2. DNA polümeraase tähistatakse I-V vastavalt avastamise järjekorrale. Polümeraas III on peamine DNA replikatsiooni ensüüm, I, II ja V osalevad pmslt vigade parandamisel. Replikatsioon bakterites: helikaasid keerutavad biheeliksi lahti; lahtikeerdumist kompenseerivad topoisomeraas; DNA polümeraas III kasutab RNA-praimereid; DNA primaas sünteesib oligonukleotiidsed RNA-praimerid. DNA polümeraas I lõikab praimerid välja. DNA ligaas täidab lüngad Okazaki fragmentide vahel. Replikatsiooni erinevused eukarüootides: eukarüootidel on mitu replikatsiooni saiti e replikaatorit. 3. Pöördtranskriptaas e RNA-juhitav DNA polümeraas retroviirustes, mis sünteesib RNA ahelale temaga komplementaarse DNA (cDNA) ahela
nimetatakse replikatsioonikahvliks. DNA polümeraas on ensüüm, mis sünteesib uut DNAd, lisades sünteesitavale ahelale nukleotiide, mis vastavad (komplementaarsuse alusel) algahelale. Lisaks DNA polümeraasile on replikatsioonikahvliga seotud veel palju teisi valke, mis aitavad kaasa DNA sünteesi alustamisele ning kulgemisele. DNA replikatsiooni saab läbi viia ka in vitro (kunstlikult, rakuväliselt). Selleks kasutatakse rakkudest eraldatud DNA polümeraase ning kunstlikke DNA praimereid, mis algatavad DNA sünteesi algahela teatud lõikudel. Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR) on kunstlikul sünteesil kasutatav tehnika. See toimub tsükliliselt ning on vajalik kindla märklaud-DNA paljundamiseks. DNA replikatsioon. kaksikheeliks on lahtikeerdunud ning mõlemad ahelad toimivad uute ahelate sünteesil matriitsina Sisukord · 1 DNA struktuur · 2 DNA polümeraas · 3 Replikatsiooni protsess o 3.1 Originid o 3.2 Replikatsioonikahvel
· Histoonid on aluselised ja DNA on happeline ja nii moodustub stabiilne kooslus kromatiin. Histooni peamine osa = oktameer (8 histooni molekuli) DNA keeratakse kaks korda ümber histoonide Nukleosoom = DNA, mida hoidab histoon paigal Nukleosoome hoiavad koos linker DNA-d DNA superkeerdumine Nukleosoomi funktsioon · Aitavad DNA molekuli keerdus hoida · Reguleerivad geeni ekspressiooni (loeng 3, 5 -genoom, ploidsus; epigeneetika) Meetodid: PCR - Polymerase chain reaction (PCR). Vaja praimereid, mis on disainitud sisestatud geeni järgi. 1. Inkubeeritakse sihtmärgi DNA-d 94 kraadi juures 1 minut, et eraldada ahelad. 2. Lisatakse praimerid, nukleotiidid ja DNA polümeraas 3. Praimerid kinnituvad üksikutele DNA ahelatele 60 kraadise ikubatsiooni ajal ühe minuti jooksul 4. Inkubeerida 72 kraadi juurres 1 minut, selle aja jooksul moodustub 2 koopiat sihtmärgi DNA-d 5
polümeraas. DNA kahekordistumine toimub semikonservatiivse mudeli järgi. See tähendab, et mõlemale vanale ahelale sünteesitakse kõrvale uus. Replikatsioon toimub 5´-3´ suunas. Protsessis on üks ahelatest juhtiv (leading strand) ja teine mahajääv ahel (lagging strand). Juhtivalt ahelalt toimub süntees pidevalt, kuid mahajääval ahelal toimub süntees 100-1000 nukleotiidiste blokkidena ehk Okazaki fragmentidena. Nende fragmentide sünteesiks kasutatakse RNA praimereid. Hiljem liidetakse tekkinud fragmendid esüümi ligaas abil. Kuna DNA repikatsiooni puhul tekib mõlema DNA ahelale kõrvale uus DNA ahel, siis nimetatakse vastavat protsessi semikonservatiivseks. Helikaas- ensüüm, mis lahutab DNA ahelad üksteisest. Enamasti funktsioneeri heksameerina. SSBP (single-strand binding protein)- seondub üheahelalisele DNA-le, hoides ära selle kaheahelaliseks muutumist. DNA replikatsiooni näol on tegemist väga täpse mehhanismiga
Esimese etapi pikkus sõltub valitud ensüümist, me kasutasime Hot FIREPol DNA polümeraasi, mis aktiveerub pärast 15 minutit inkubeerimist 95 o C juures. Teine etapp on vajalik selleks, et kas lisatud template DNA või eelmises tsüklis sünteesitud DNA ahelad denatureeruks, see peab olema võimalikult lühike. Kolmanda etapi (annealingu) pikkus sõltub kasutatud praimerite järjestusest mida suurem on G-de ja C-de arv, seda rohkem on vaja aega annealinguks. Kuna me kasutasime erinevaid praimereid, kuid sama programmi, ei pruugi annealingu aeg olla täiesti optimaalne, kuid siiski piisavalt täpne. Sünteesi pikkus sõltub nii kasutatavast ensüümist kui ka paljundatava järjestuse pikkusest, kuna me kasutasime kõik sama programmi, siis on valitud pigem pikem aeg (valitud on 3 minutit, lühemate järjestuste puhul piisaks ka 1 minutist). Korduste arv sõltub sellest, kui palju on vaja DNA-d saada, samas liiga palju tsükleid suurendab vigade tõenäosust. c)
Produkt hakkab denatureeruma (uurea vmt toimel) erinevates piirkondades sõltuvalt mutatsiooni olemasolust. Keemiline RNAas vahendatud: üks praimeripaar on biotiiniga märgistatud. Kui tekib heterodupleks ja seal on mullike (mittepaardumine)....(?) Kui on fluorestseeruv praimer, saame lisapiigi. Valgu lühenemise test: Stoppkoodonite tuvastamiseks. In vitro translokatsioon. Tohutult suure geeni korral kasutada hoopis RNAd, sest see on palju lühem. Tehakse sealt cDNA, kasutatakse praimereid, kus on promootoralad (nt sp6) sellised cDNAsid saab in vitro transleerida/transkribeerida. Multipleks PCR skriining: Näeb, kui suur ala erinevatel patsientidel geenist kadunud on. 16. Dünaamiliste mutatsioonide tuvastamine Need on mittemendeliaalselt päranduvad mutatsioonid; peamiselt tripletid ja põhjustavad enamasti neuromuskulaarseid haigusi: Fragile X (levinuim X-liiteline idiootsus), mutatsioonid intronites (mõjutavad transpordi, splaissingut jne). Testimine:
kindlaksmääramisel nende ristsidumisega. Toimub kolme sammuliselt: 1. Ristsidumine – formaldehüüdi lisamisel üksteisele lähedal asuvad kromatiini segmendid ristseotakse. DNA segmendid ristseotakse valkudega ja valgud ristseotakse üksteisega. 2. Kromatiin fragmenteeritakse ja ligeeritakse 3. DNA puhastatakse ja analüüsitakse (qPCR, sekveneerimine) 3C: one by one analüüs – kasutab 3C lookus-spetsiifilisi praimereid. Tulemus nt interaktsiooniprofiil valitud geenist näitab promootori ja ümbritseva kromatiini interaktsiooni. 4C: tsirkulariseeritud 3C, one by all analüüs – üle genoomne interaktsiooniprofiil üksikule lookusele. 5C: many by many analüüs – analüüsib interaktsioone kahe suurema lookuste kogumi vahel, nt promootorite kogumi ja distaalsete regulatoorsete elementide kogumi vahel. Ehk võimaldab analüüsida interaktsioone mitme valitud lookuse vahel.
DNA sünteesi reaktsiooni jaoks oli vaja DNA polümeraasi (ensüümi), matriits-DNA, dNTP (4). Tegelikult sellisel kombel reaktsiooni ei toimu. Puudu on praimerid (lühike DNA lõik). DNA polümeraas ei suuda hakata nullist DNA ahelat sünteesima, küll aga olemasolevat ahelat pikemaks tegema. Denatureerides (lahti keerutades) kaheahelalist DNA molekuli temperatuuri toimel saame kaks üheahelalist DNA molekuli. Lisades nüüd katseklaasi sobivaid praimereid, suudab polümeraas sünteesida uue ahela ja saame kaks kaheahelalist DNA molekuli. Esimese tsükli alguses DNA proov toatemperatuuril. Tahtes ahelaid lahku viia tuleb proovi tõsta ~100 o ni. Tahtes praimerite seondumist DNA üksikahelaga tuleb proovi jahutada ~50o juurde. Tahtes DNA'd sünteesida tuleb temperatuuri veel alandada. Järgmises tsüklis tahtes
sünteesifaasi pikkus varieerub sõltuvalt sünteesitava DNA fragmendi pikkusest. Pärast sünteesi segu uuesti kuumutatakse 94 kraadid ja algab uus PCR tsükkel. Kogu protsess (u 20 korda) võtab paar tundi. PCR piirangud – enne kui mingit DNA lõiku paljundada, peame teadma vähemalt osaliselt selle järjestust (ideaalis kogu ulatuses, et olla kindel praimerite spetsiifilisuses). Teiseks võib olla teatud tingimustes raske tekitada praimereid, mis oleks unikaalse järjestusega. Genoomis on palju kordusjärjestui ning vahel on nad oluliseks segavaks teguriks, kui tahta tekitada praimerit, mis seonduks ainult ühte kohta genoomis. Kolmandaks piiravaks teguriks on paljundatavte DNA fragmentide pikkus. Tüüpiliselt on PCR-iga võimalik paljundada 100-10 000 aluspaari pikkuseid DNA lõike, nii et kui meid huvitav DNA piirkond on sellest pikem, eu saa seda ühe pika fragmendina taolisel moel amplifitseerida. PÕHIMÕTE:
(rasvhappe molekulile lisatakse CoA molekul, mille tulemusel tekib atsüül-CoA). Atsüül-CoA transporditakse mitokondrite maatrikssise karnitiini abil. Mitokondrite maatriksis algab -oksüdatsioon. Rasvhapete kataboliseerimine b-oksüdatsioonil toimub: · Maksas · Südames · lihastes 12. Selgitage DNA polümeraaside rolli replikatsiooniprotsessis. Miks vajavad DNA polümeraasid toimimiseks praimereid ja mida praimerid endast kujutavad? DNA-polümeraas sünteesib mõlema DNA ahelaga komplementaarsed uued DNA ahelda, peale seda kui helikaas on DNA kaksikahel lahti keeranud. DNA primaas sünteesib replikatsiooni alguskohale praimeri. DNA polümeraas jätkab praimeri lõpust edasi, liites praimeri 3'-OH otsa järgmise nukleotiidi, selle vabasse otsa järgmise jnejne. 13
replikatsiooniharki, mis liiguvad vastassuunas poolkatkendlik (semidiscontinuous) üks ahel (nn juhtiv ahel) kopeerub katkematult, mahajääv ahel kopeerub segmentide kaupa (Okazaki fragmendid), mis seejärel omavahel ühendatakse Replikatsiooni ensüümid: DNA polümeraasid - katalüüsivad 3'®5' fosfodiester- sidemete sünteesi : DNA polümeraas III - peamine replikatsiooni ensüüm, vajab RNA praimereid ; 10 subühikut, kiirus kuni 1 kb/s DNA polümeraasid I, II ja V - osalevad peamiselt vigade parandamisel DNA Polümeraas I lõikab praimerid välja ja täidab lüngad Helikaasid kaksikheeliksi lahtikeeramine DNA güraas e. topoisomeraas lahtikeerdumisest tingitud pingete kompenseerimine, st DNA ahela läbilõikamine ja taas-ühendamine DNA primaas oligonikleotiidsete RNA-praimerite süntees DNA ligaas ühendab Okazaki fragmendid
Multipleks PCR korral osaleb rohkem kui üks praimerite paar. Ühte reaktsiooni võib panna praimerid, mis on spetsiifilised erinevatele mikroorganismidele. Nested PCR on sisuliselt kaks järjestikust PCR reaktsiooni, kus teine PCR tehakse uue praimeripaariga esimese PCR produkti peal. Esimese reaktsiooniga saadakse amplikon sihtmärk- DNA-st. Seda amplikoni kasutatakse sihtmärgina teises reaktsioonis, kusjuures kasutatakse praimereid, mis asetsevad esimesest praimeri paarist seespool. Teise reaktsiooni käigus saadakse lühemaid nukleotiidahelaid. Nested PCR eeliseks on väga suur sensitiivsus ja spetsiifilisus. Samas on reaktsioon väga tundlik saastumisele varasema PCR produktiga, mistõttu tekivad kergesti vale-positiivsed tulemused. Arbitrary primed PCR (RAPD PCR) puhul kasutatakse lühikesi praimereid (kuni 10 nukleotiidi), kusjuures nende järjestus valitakse juhuslikult. Tulemuseks on erineva pikkusega
on vaja vaba 3' OH otsaga praimerit juhtival vaja ainult alguspunktis. Mahajäävalt: kuna DNA ahelad on antiparalleelsed, siis teise ahela puhul, mis pikeneb 3'-5' suunas, toimub tegelikult ka 5'-3' suunaline süntees. Kuid katkendlikult, lühikeste fragmentidena, mida nim Okazaki fragmentideks. Okazaki fragmentide initsiatsiooniks on vaja praimosoomi. Liigub mööda DNA molekuli, kasutades ATP-d. Helikaas keerab kaksikahela lahti, promaas sünteesib praimereid. RNA praimeritelt jätkab sünteesi DNA polümeraas III. Topoisomeerid teevad ahelatesse ajutisi katkeid, et soodustada DNA-ahelate lahtikeerdumist. Mahajääv ahel on DNA replikatsioonikompleksis linguna kaasas. 53. Võrrelge bakteri ja eukarüoodi kromosoomide replikatsiooni. Eukarüoodil: DNA süntees toimub ainult rakutsükli ühel etapil (S faasis) ja algab paljudest kohtades korraga. Juhtiva ja mahajääva ahela sünteesiks on 2 erinevat DNA polümeraasi.
aluspaare) ja aitavad sellega lahtikeerdumisele kaasa, sest A-T aluspaaridel on kaks vesiniksidet (mitte kolm, nagu C-G paaridel). Seega on A-T sidemeid lihtsam lõhkuda, sest väiksema arvu vesiniksidemete lõhkumise jaoks kulub vähem energiat. Pärast DNA ahelate eraldamist luuakse algahelatele RNA praimerid. Juhtivale DNA ahelale sünteesitakse üks RNA praimer aktiivse origini kohta, mahajäävale ahelale sünteesitakse aga mitmeid praimereid, neid nimetatakse avastaja järgi Okazaki fragmentideks. DNA polümeraas pikendab juhtivat ahelat pidevalt, mahajäävat ahelat aga fragmentide kaupa. RNaas eemaldab replikatsiooni initsiatsiooniks kasutatud RNA praimerid, ning teist sorti DNA polümeraas liitub ahelatega, et täita sünteesimata fragmente. Pärast seda liitub DNAga ligaas, mis liidab augud ahelas ning lõpetab sellega replitseeritud DNA molekuli sünteesi. 8. Mis on geen?
Kasutab ATP energiat ja seondub ühe ahela ümber, ATP hüdrolüüs lahutab ahelad. Aktiveerib DNA primaasi. 2) SSBs – üheahelalise DNA-ga seostuvad valgud, kaitsevad lahtist DNA-d, et muu sinna ei seostuks ja et seda ära ei Dnaasitaks. Seondub kohe üheahelalise DNA-ga ja ei lase ahelatel kokku minna. 3) Topoisomeraasid – kompenseerivad DNA topoloogilisi pingeid, „vedru“ pingest vabaks. Eemaldab supervindid. 4) DNA primaas – ensüüm, mis sünteesib DNA replikatsiooni praimereid, DNA sünteesil on selleks RNA (esineb RNA praimer). DNA primaas toodab RNA praimerei DNA jaoks. Ajab SSBs-id ära ja sünteesib RNA praimeri replikatsiooni alguspunkti. Liitub üheahelalisele DNA-le. Sinna peab pärast DNA polümeraas II holoensüüm seonduma. Tekib nii peaaegu valmis kompleks, mis on valmis DNA-d sünteesima. Peavad veel lisanduma sliding DNA clamp (libisev klamber), mis võtab DNA ringi sisse ja moodustab DNA ringi. 5) DNA polümeraasid – DNA sünteesi läbiviiv ensüüm
Tsütokiinide tootmist on võimalik määrata ka tsütokiinide mRNA olemasolu ja hulga järgi aktiveeritud T- rakkudes. mRNA-d saab määrata üksikute rakkude puhul in situ hübridisatsiooniga, rakupopulatsioonides pöördtranskriptaasi polümeraasi ahelreaktsioonil (RT-PCR). RT-PCR-il isoleeritakse rakust mRNA, mille baasil sünteesitakse pöördtranskriptaasi abil DNA. Soovitud DNA-lõiku paljundatakse PCR-il, kasutades järjestus-spetsiifilisi praimereid. Reaktsiooni saadusi geelelektroforeesil lahutades saadakse spetsiifilise kujuga bändid. Amplifitseerunud DNA-järjestuse hulk vastab tema esindatusele mRNA-s: aktiivselt teatud tsütokiini tootvates T-rakkudes on hulgaliselt konkreetset mRNA-d, seega ka vastavalt suur hulk DNA-d RT-PCR-il. Tsütokiini-mRNA taseme hindamiseks algses koes võrreldakse saadud tulemust RT-PCR-il saadud kõigis rakkudes ekspresseeritud housekeeping- geenide mRNA hulgaga.
annaabi.ee 
