vabastada. Arvutused: 0,1g geeli kohta 300µl. 1,5x300=450µl Töö käik: Lõikan skalpelliga geelist enda fragmendi välja. (0,15g) Lisan ADB puhvri geelile. Inkubeerime 55kraadi juures 5minutit, kuni geel on täielikult sulanud. Pipeteerin kogu koguse ränikolonni. Tsentrifuugin – DNA jääb räni külge ja ülejäänud puhvri viskan ära. Pipeteerin peale 200 µl pesupuhvrit, tsentrifuugin ja kordan. Tõstan kolonni puhtasse 1,5ml tuubi. Elueerin DNA kolonnist elueerimispuhvri abil. Inkubeerin paar minutit laua peal Tsentrifuugin 1 minuti. Seejärel on tuubi põhjas elueerinud PCRi produkt lahustatune elueerimispuhvris. Kontrollimiseks segan kokku 2 µl eluaati, 6,33 µl MQ ja 1,66 µl 6x värvi. Tsentrifuugin ja kannan geelile. Geeli pilt tulemuste all. Tulemus: Minu rada nr8.
35. Plasmiid mEB1 pEGFP-N1, praimerid mEB1F ja mEB1R. Oodatav pikkus – 700 aluspaari. 36. Puhastamine: 1. Saadud geelitükk kaalus 0,04 g. Lisasin 120 μl ADB-d (0,3 ml 0,1 g geeli kohta) 2. Inkubeerisin 37 °C juures 5 minutit, et geelitükk oleks täielikult sulanud 3. Pipeteerisin segu kolonni, mis on omakorda kogumistopsis. Tsentrifuugimine – 30 sek, et kogu lahus jookseks läbi kolonni. Visasin läbivoolatud puhver kolonnist ära. 4. Pipeteerisin peale 200 μl pesupuhvrit. Fuugimine – 30 sek, visasin läbivoolatud puhver kolonnist ära (seda etapi tuleb korrata 2 korda) 5. Järgmisena pipeteerisin kolonni keskele 10 μl MQ vett (elueerimiseks). Vett saab kasuta ainult juhul, kui selle pH > 6,0. 6. Jälle fuugimine 1 minuti jooksul – praimerite, nukleotiidide ja erinevate soolade eraldamine. Epsis on elueerinud PCRi produkt, mis on valmis edasiseks ligeerimiseks. 37. 38. 39. 40. Kontrollgeeli pilt
sulamiseni. Vahepeal nipsutasin tuubi, et kiirustada sulamist. 4. DNA – geeli – puhveri segu pipeteerisin Zymo-SpinTM kolonni (mis oma korda koosneb kolonnist ja kogumistopsist. Kolonn sisaldab ränifiltri, läbi mille me laseme oma segu jooksma. DNA seostub räniiksiidi osakestega, sellega ta ei saata kogumistopsi, vaid jääb kolonni filtri peale. Kolonni saagis minu DNA lõigule on vahemikus 70-90%) ja tsenrifugeerisime 30sek ja viskasin läbivoolatud puhver välja. 5. Lisasin 200µl pesupuhvrit ja jalle fuugisin 30 sek x2 korda, et olla kindel, DNA on puhas. 6. DNA elueerimiseks kasutasime MQ vett, mille pH oli > 6.0 (teisel juhul, DNA võib kahjustuda). Panin 10µl MQ vett peale ja fuugisin 1 min jooksul. DNA vabanes ränioksiidist ja sai kogumistopsiku sisse. 7. Kontrollin, kas eluaat sisaldab minu DNA lõiku, või puhastamise jooksul tekkisid vead: segasin kokku 1,8 µl DNA värvi, µl MQ H2O ja µl eluaati, ning panin jooksma kontrollgeelile (kokku on 10,8 µl).
annaabi.ee 
