50 μl 1M NH4Cl + 50 μl 10% Triton X-100 + 100 μl 10x PBSi + 800 μl MQ Blokklahus: 2% BSA, 0,1% NaN3 PBSis, 2 ml (oli valmis) 150. 0,04 g BSA-d + 20 μl 10% NaN3 + 1,98 ml MQ 151. 152. 2. Fikseerimine: rakkudelt eemaldada vaakumiga sööde, lisada 0,5 ml fikseerimislahust, inkubeerida 15 min ning pesta rakke ülearusest PFAst 3 korda 5 minutit (kokku) 1 ml 1x PBSiga. 3. Neutraliseerimine ja permeabiliseerimine: lisada rakkudele 0,5 ml permeabiliseerimislahust (lahustab osaliselt rakumembraanide lipiidid, et antikehad hiljem rakku pääseks), inkubeerida 15 min ning pesta rakke 2 korda 5 minutit (kokku) 1 ml 1x PBSiga. 4. Blokeerimine: lisada rakkudele 0,5 ml blokklahust, jätta seisma +4°C juures. Blokeerimise eesmärk on BSAga katta ära need kohad, kuhu igasugused valgud kleepuvad. Kuna antikehad on ka valgud, siis see etapp takistab antikehade ebaspetsiifilist seondumist. 153. 154. 155. 156
valkude ja DNA asukoha rakus ning seeläbi jääb püsima ka raku kuju. Rakud ei lagune, seega saab vaadata kus kohas paiknes uuritav valk fikseerimise ajal. • inkubeerida 15 min • pesta rakke ülearusest PFAst 3 korda 5 minutit (kokku) 1 ml 1x PBSiga. Ülearune vaba PFA tuleb välja pesta, et hiljem ei reageeriks BSA ega antikehadega. Neutraliseerimine ja permeabiliseerimine: • lisada rakkudele 0,5 ml permeabiliseerimislahust • inkubeerida 15 min • pesta rakke 2 korda 5 minutit (kokku) 1 ml 1x PBSiga. Blokeerimine: • lisada rakkudele 0,5 ml blokklahust • jätta seisma +4°C juures. Blokeerimise eesmärk on BSAga katta ära need kohad, kuhu igasugused valgud kleepuvad. Kuna antikehad on ka valgud, siis see etapp takistab antikehade ebaspetsiifilist seondumist. Teine päev – immuunotsütokeemia
annaabi.ee 
