a. 0,25 ml 1M NH4Cl varulahust b. 0,25 ml 10% Triton X-100 c. 0,5 ml 10x PBS-i d. Lisada vett 5 ml-ni, segada (mitte vahtu ajada). 5. Blokklahus: 2% BSA, 0,1% NaN3 PBSis, 2ml a. 0,04 g BSA-d b. 0,02 ml 10% NaN3 c. Lisada 1xPBS-i 2ml-ni. I Fikseerimine 1. Rakkudelt eemaldada vaakumiga sööde 2. Rakud fikseerida 0,5 ml 4% PFAga PBSis, inkubeerida 15 minutit toatemperatuuril. 3. Pesta rakke 3 korda 5 minutit á 1 ml 1x PBSiga. II Neutraliseerimine ja permeabiliseerimine 1. Lisada rakkudele á 0,5 ml 50mM NH4Cl + 0,5% Triton X-100 PBSis, inkubeerida 15 minutit toatemperatuuril. 2. Pesta rakke 2 korda 5 minutit á 1 ml 1x PBSiga. III Blokeerimine Lisada rakkudele á 0,5 ml 2% BSA PBSis, millele on lisatud 0,1% NaN3, jätta seisma üleöö (üle nädalavahetuse) +4°C juurde. IV Inkubatsioon primaarse antikehaga 1. Valmistada primaarse antikeha lahjendused (kulub 200 µl ühe klaasi kohta) 0,2% BSA- PBS lahuses a. 40 µl 2% BSA lahust b. 360 µl 1x PBSi c
149. 50 μl 1M NH4Cl + 50 μl 10% Triton X-100 + 100 μl 10x PBSi + 800 μl MQ Blokklahus: 2% BSA, 0,1% NaN3 PBSis, 2 ml (oli valmis) 150. 0,04 g BSA-d + 20 μl 10% NaN3 + 1,98 ml MQ 151. 152. 2. Fikseerimine: rakkudelt eemaldada vaakumiga sööde, lisada 0,5 ml fikseerimislahust, inkubeerida 15 min ning pesta rakke ülearusest PFAst 3 korda 5 minutit (kokku) 1 ml 1x PBSiga. 3. Neutraliseerimine ja permeabiliseerimine: lisada rakkudele 0,5 ml permeabiliseerimislahust (lahustab osaliselt rakumembraanide lipiidid, et antikehad hiljem rakku pääseks), inkubeerida 15 min ning pesta rakke 2 korda 5 minutit (kokku) 1 ml 1x PBSiga. 4. Blokeerimine: lisada rakkudele 0,5 ml blokklahust, jätta seisma +4°C juures. Blokeerimise eesmärk on BSAga katta ära need kohad, kuhu igasugused valgud kleepuvad. Kuna antikehad on ka valgud, siis see etapp takistab antikehade ebaspetsiifilist seondumist. 153. 154.
PFA tekitab kovalentsete sidemete võrgustiku säilitades valkude ja DNA asukoha rakus ning seeläbi jääb püsima ka raku kuju. Rakud ei lagune, seega saab vaadata kus kohas paiknes uuritav valk fikseerimise ajal. • inkubeerida 15 min • pesta rakke ülearusest PFAst 3 korda 5 minutit (kokku) 1 ml 1x PBSiga. Ülearune vaba PFA tuleb välja pesta, et hiljem ei reageeriks BSA ega antikehadega. Neutraliseerimine ja permeabiliseerimine: • lisada rakkudele 0,5 ml permeabiliseerimislahust • inkubeerida 15 min • pesta rakke 2 korda 5 minutit (kokku) 1 ml 1x PBSiga. Blokeerimine: • lisada rakkudele 0,5 ml blokklahust • jätta seisma +4°C juures. Blokeerimise eesmärk on BSAga katta ära need kohad, kuhu igasugused valgud kleepuvad. Kuna antikehad on ka valgud, siis see etapp takistab antikehade ebaspetsiifilist seondumist.
annaabi.ee 
