Nukleotiidid on estrid, aga kuna fosforhappe jäägis on veel happelisi vesiniku aatomeid, käituvad nad hapetena. Nt: adenüülhape, guanüülhape, tsütidüülhape, uridüülhape. Kui moodustub fosforhappega ester, tekib väga tähtis aine ehk adenosiin-3',5'-fosfaat. Selle ühendi tähis on cAMP. Ta osaleb rakkudes välise keemilise signaali ülekandmises raku sisemusse. Nukleiinhape- nukleotiid koos oma fosforhappejäägiga moodustab estri koos teise nukleotiidiga ja nii moodustuvad oligonukleotiidid ja edasi polünukleotiidid, mis ongi nukleiinhape. Organismis on need DNA ja RNA. Neid sünteesitakse rakus vastavate ensüümide vahendusel. DNA makrostruktuur on kaheahelaline biheeliks. Selle moodustavad 2 antiparalleelset polünukleotiidi ahelat, mis keerduvad ümber ühise telje. Fosforhappe jäägid ulatuvad heeliksist väljapoole, kus nad seovad DNA pakkimiseks vajalikke valgumolekule ioonsete sidemetega. DNA ahelad püsivad koos tänu komplementaarsusele, s
Illumina Solexa tehnoloogia puhul algab töö genoomse DNA fragmeteerimisega ultraheli vahendusel, mille tulemusel saadakse suhteliselt ühtlase pikkusega DNA segu. Seejärel liidetakse nende DNA lõikude otstesse adapteroligonukleotiidid ja puhastatakse. Nüüd järgneb DNA amplifitseerimine, mis Illumina platvormi puhul toimub tahkele kandjale seotult. Selleks kasutatakse nn. Flow-Cell-i, kus paiknevad adapteritega komplementaarsed oligonukleotiidid, millele liidetakse DNA fragmendid. Sildamplifikatsiooni tulemusena tekivad Flow-Cell põhja identse järjestustega DNA klastrid Sekveneerimiseks kasutatakse eemaldatava floresentsiga terminaatnukleotiide ja vastavat DNA polümeraasi. Ühe sekveneerimise tsükli kohta liidetakse üks komplementaarne nukleotiid, loetakse ära sellega seotud fluorestsentsmärge 8 ning siis eemaldatakse antud fluorofoor ja blokaatorgrupp. SOLID tehnoloogia põhineb sünkroonsetes ligeerimistsüklites
viimiseks. Nukleiinhappe primaarstruktuur Nukleotiidid on ühendatud lineaarseks polümeeriks nukleiinhappeks 3´5´ fosfodiestersidemetega Mononukleotiidid Nukleiinhappe Dinukleotiidid molekul sisaldab Trinukleotiidid ühte negatiivset Oligonukleotiidid laengut ühe Polünukleotiidid monomeerijäägi kohta Kokkuleppeliselt kirjutakse RNA ja DNA primaarstruktuuri suunas 5´ 3´. 5´ ATTAGGAACCGG 3´ Fosfodiestersideme moodustumine ja stabiilsus Põhimõtteliselt võiks moodustuda dehüdratatsioonireaktsioonis: kuid G0=+25 kJ/mol
arengut · Von Gierke haigus (glükoos-6-fosfataasi defitsiit süsvesikute metabolismihäire; maksa rasvumine, hüpoglükeemia oht. · Galaktoseemia (galaktoosi kinaasi defitsiit) tekib liiga palju alkoholi, vett, silm · Gaucher haigus (glükotserebrosidaasi defitsiit) lipiidide metabolismi häire (vaimsed, psüühilised häired. Antisensoligonukleotiidid ja PNA · Sünteetilised oligonukleotiidid moodustavad heterohübriidid mRNA-ga · Tulemuseks on valgu sünteesi inhibitsioon · PNA peptiidnukleiinhape (kunstlik peptiidnukleiinhape) · Meetod pole läbinud kõiki vajalikke uuringuid
Sünteetilised geenid väikestest sünteesitud oligonukleotiididest: Oligonukleotiide keemiliselt sünteesitakse (20-60mers) nii, et nende järjestused pärast annealingu moodustuksid kaksikahelat. In vitro süntees: sünteesitud oligonukleotiidid on projekteeritud nii, et moodustada baaspaare, mille vahel on tühikud. Suurte geenide süntees: rohkem kui 1000bp. Kogu geeni võib moodustada mitmetest oligonukleotiididest, millest 4-6 on omavahel kattuvad (overlapping). Fill-in meetod over-lapping oligonucleotides: Kaks 60-80 mer oligonukleotiide võib sünteesida overlapping otstega. 19. Kirjelda detailselt, kuidas on võimalik, kasutades kahte kattuvat oligonukleotiidi ja
Tulemusena tekib mõlemale DNA üksikahelale komplementaarne ahel. 4) Eelpoolmainitud etappe (tsükleid) korratakse 20–30 korda, et amplifitseerida piisav arv DNA molekule. 18. Millist polümeraasi kasutatakse PCR protseduuril ja miks? Mikroorganismist Thermus aquaticus pärit DNA Taq polümeraasi, kuna see on kuumale vastupidav ning ei denatureeri 94º C juures. 19. Mis on praimerid? 15-25 nukleotiidi pikkused komplementaarsed oligonukleotiidid, mida kasutatakse PCR-is. Praimer on lühike (tavaliselt umbes kümme aluspaari pikkune) nukleiinhappe lõik, mis on DNA replikatsiooni alguskohaks. 20. Kes töötas välja PCR meetodi? 2:2-3. PCR meetodi leiutas 1983 Kary Mullis. 21. Mis on geel-elektroforees ja milleks seda kasutatakse? 2:11-15. Elektroforees on meetod mis võimaldab eri tüüpi molekule üksteisest lahutada järgnevate karakteristikute järgi: elektriline laeng, suurus, kuju.
1. DNA ahelate denatureerimine. Kui DNA on rakust eraldatud ja puhastatud, võib alustada PCR-analüüsi. DNA denatureerimiseks kuumutatakse DNA-d 9095 °C juures, mille käigus DNA biheeliks laguneb kaheks üksikahelaks. See on vajalik huvipakkuvate fragmentide paljundamiseks. PCR-i puhul on vaja teada lühikesi järjestusi kahel pool sünteesitavat piirkonda. Külgnevate järjestuste järgi on sünteesitud komplementaarsed praimerid, tavaliselt 1525 nukleotiidi pikkused oligonukleotiidid. Nende seondumine DNA-ga on vajalik, kuna alad, kuhu praimerid kinnituvad, on fragmentide sünteesi initsiaatoriteks. Praimerid seonduvad komplementaarsusprintsiibi alusel mõlemale poole piirkonda. 2. Praimerite seondumine DNA ahelatega. Praimerite seondumine ehk annealing toimub 5070 °C juures. Selleks, et kinnitustemperatuur mõistlik oleks, tulebki praimerid teha 20 nukleotiidi pikkused. Sellisel juhul ongi nende sulamistemperatuur vajalikus vahemikus. 3. DNA süntees
molekulide kogumeid (nt metaboliidid, antibiootikumid jne). Inimgeneetikas oluline metabolismi ja selle häirete uurimiseks. 17. Kirjelda teise põlvkonna sekveneerimise proovi ettevalmistamise etappe! Millele tuleb tähelepanu pöörata ning mis võib põhjustada proovi halva kvaliteedi? DNA purustatakse, et saada fragmendid. Siis liidetakse neile mõlemasse otsa ühenukleotiidilised A otsad ehk adenüleeritakse ning siis ligeeritakse sinna külge adapter-oligonukleotiidid. Saadud fragmendid selekteeritakse suuruse järgi ja puhastatakse. Sellele järgneb klastrite genereerimine Flow-cell’is. Flow-cell põhjas on lühikesed oligonukleotiidi järjestused, mis on komplementaarsed DNAle liidetud adapteritega. DNA denatureeritakse üheahelaliseks ning liidetakse flow-celli põhjas olevatele oligonukleotiididele. Toimub sildamplifikatsiooni teke, mille tulemusel tekivad identsed DNA klastrid. Peale amplifikatsiooni DNA fragmendid
fluorestseeruvuse alusel mikroskoobi all mehaaniliselt, eemaldatakse kandjalt ja sekveneeritakse. Mittepeptiididel o Individuaalne ühendi süntees ja tagging o Ühel kandjal paralleelselt kahe ühendi süntees: eesmärkühend ja kodeeriv märkühend igale etapile. o See nõuab tahkelt kandjalt olema kaks eristatavat linkerit. o Märkühendid võivad olla peptiidid, keemilised märgid või oligonukleotiidid. o Vabastamine kandjalt peab olema selektiivne. Kodeeritud plaadid polüpropõleenist tahke kandjaga Eraldi reagendiga töötlemine Lõigatakse kolmeks kolonniks -> komplekt, kus igast plaadist 1 kolonn (kokku 3 kolonnide komplekti). komplektide töötlemine kindla reagendiga kolonnide ruutudeks lõikamine ja komplekti moodustamine (igast kolonnist 1 ruut, kokku 3 ruutude komplekti)
·Hübridisatsioon toimub 37°C ·Mitteensümaatilin ·Kromosoomide analüüs toimub skaneeriva lähivälja optilise mikroskoopia (SNOM) abil ·Eelis kromosoomide ja kromatiini intaktsuse säilimine 5. COMBO-FISH (combinatory oligonucleotides) · Madaltemperatuuri FISH edasiarendus · Põhineb faktil, et 1-2% inimgenoomist on ~ 14 aluspaarised homopuriin või homopürimidiin järjestused · Proovina homopuriin või homopürimidiin oligonukleotiidid, mis moodustavad DNA-ga kolmikahela · DNA eelnev denaturatsioon pole vajalik ! Suured laigud on mittespetsiifiliselt värvunud tuumakesed 6. Fiber-FISH Kasutatakse väljavenitatud kromatiinkiudusid. Eriline lüüsipuhver, mis lõhub ka tuumamaatriksi. DNA pikeneb 130% teoreetilisest väärtusest! Lahutusvõime paar kb d! 7. Kolmedimensionaalne FISH Kromosoomiterritooriumid intaksetes interfaasi tuumades konfokaalmikroskoopia vahendusel 7.Võrdlev genoomne hübridisatsioon
Minimaalne tööjõu kulu. DNA fingerprinting ehk DNA tüpiseerimine (profiling). Ei ole olemas kahte ühesuguse genotüübiga sugulisel teel paljunevat organismi (va. Ühemuna kaksikud) sest: Meioosi I profaasis ristsiire homoloogsete kromosoomide vahel; Juhuslik homoloogide jaotus gameetide küpsemisel; Mutatsioonid; DNA replikatsiooni vead. DNA fingerprinting markerid: RFLP (restriktsiooni saidid). Polümorfsed lõikude pikkused detekteeritakse PCR(forees). Alleel-spetsiifilised oligonukleotiidid. Kordus DNA. Minisatelliidid (VNTR = variable number tandem repeats) - kordused 5-10 aluspaari ( A. J. Jeffreys 1985). Mikrosatelliidid (STR = short tandem repeats) - kordused 2-6 aluspaari. Markerite valiku kriteeriumid: Peavad olema polümorfsed, ainult siis on informatiivsed. Markerid peavad olema ühes lookuses (ainult ühes kohas genoomis). Markerid on neutraalsed ehk ei ole seotud valiku või adaptatsiooniga. Markerid peaks olema eri kromosoomides, et nad oleks üksteisest sõltumatud.
endo- ja eksoribonukleaasideks. Eksoribonukleaasid Erinevalt eukarüootidest on bakteritel kirjeldatud ainult 3' 5' suunas mRNA-d lagundavaid eksoribonukleaase. Põhilised mRNA-d degradeerivad eksoribonukleaasid on polünukleotiidi fosforülaas ja RNaas II. Juhul, kui degradatsiooni käigus ei tule ette ületamatuid sekundaarstruktuure, jäävad algsetest mRNA molekulidest järele ainult lühikesed, 10 20 nt-pikkused oligonukleotiidid molekulide 5' otstest. Tekkinud oligod degradeerib RNaas I. Paljudel mRNA-del on 3' otsas juuksenõelastruktuur, mis on mRNA-d stabiliseeriva toimega. Arvatakse, et see juuksenõelastruktuur ei pruugi alati sugugi olla transkriptsiooni terminaator, vaid hoopis pikema transkripti 3' 5' suunas toimunud degradatsiooni produkt. mRNA 3' otsas moodustunud juuksenõelastruktuuride stabiliseeriva toime uurimine in vivo ja in vitro katsetes on andnud vastuolulisi tulemusi
annaabi.ee 
