Praktiline töö nr. 5: Rekombinantse plasmiidi ligeerimine Eesmärk: Meid huvitava aplifitseeritud DNA järjestuse sisestamine vahevektorisse ehk paljundusplasmiidi. Materjalid: 1,25 µl pSTBlue-1 vektor Lineaarne vahevektor, kus on origin, (16ng/µl) antibiootikumide resistentsusgeen, lacZ üksus ja AccepTor kloneerimissait. 3,75 µl PCR produkt Sisaldab inserti 1 µl 10X ligeerimispuhvrit Loob sobiva keskkonna 0,5 µl T4 DNA ligaasi (5U/µl) Ligeerib inserdi ja vektori kokku 3,5 µl MQ lahusti Arvutused: Vektor: 16/1 = 20/x x = 1,25 µl PCR produkt: 150ng/10µl=15ng/µl PCR vektrori suhe peab olema 3:1. Ehk PCR võtame 3*1,25*3,7 µl 10x puhver: 10/10 = 1 Ligaas: 5U/ µl tahame saada 2,5U ehk võtame 0,5 µl
lugemisraami, -galaktosidaasi ei ekspresseerita, eelkirjeldatud protsessi ei toimu ning kolooniad jäävad valged. See võimaldab vaatluse teel eristada kolooniaid, kus insert on plasmiidi sisenenud, ja kolooniaid, kus on vaid tühi plasmiid. e) Ligeerimisprotokoll: 1. Pipeteerida ligeerimissegu (kokku 5 l): 1 l puhastatud PCR produkti 1 l plasmiidi (9ng/ l) 0,5 l 10x ligeerimispuhvrit 0,5 l e. 5 ühikut T4 DNA ligaasi (5 U/l)(hoida jääl või külmakehas) 2 l Milli-Q vett 2. Homogeniseerida lahus pipeteerimise või vortexi teel (kasutasin pipeteerimist). 3. Vajadusel tsentriguugida segu põhja (kuna kogu ligeerimissegu pipeteerisin põhja ühte tilka kokku ning vortexit ei kasutanud, polnud vajadust tsentrifuugimiseks). 4. Ligeerida +4oC juures üleöö. 4. Transformeerimine
+ 1 l restriktaasi Cfr42I (jääl) (2) Peata restriktsioon kuumutades 65 oC 20 min (restriktaas inaktiveerub). Tsentrifuugi, et eemaldada kaanelt kondenseerunud veeaur ja seejärel sega lahuse ühtlustamiseks. (3) Ligeerimisreaktsiooniks pipeteeri järgmisi komponente sellises järjekorras (teostab iga üliõpilane): 3 l restrikteeritud genoomset DNA-d + 1 l Cfr42I restrikteeritud pBS SK+ plasmiidi (10 ng) (teostatud juhendaja poolt) + 1 l 5 x ligeerimispuhvrit kokku 6 l + 1 l (5 ühikut) T4 DNA ligaasi (jääl) Selleks, et toimuks konkatemeersete DNA struktuuride moodustumine, peab [DNA] > 5 ng/l. (4) Inkubeeri toatemperatuuril kuni 24 h. Reaktsiooni võib alustada ka madalamal temperatuuril (näiteks 15 oC). Inkubeerimisaegadel lahendada allpool toodud lisaülesanne, vt lisamaterjale ja kuula juhendaja näpunäiteid.
Tsentrifuugi, et eemaldada kaanelt kondenseerunud veeaur ja seejärel sega lahuse ühtlustamiseks. (3) Ligeerimisreaktsiooniks pipeteeri järgmisi komponente sellises järjekorras (teostab iga üliõpilane): Ligeerimine kahe nukleiinhape molekuli kokku kleepumine, kasutades fermenti DNA-ligaas. 3 l restrikteeritud genoomset DNA-d + 1 l Cfr42I restrikteeritud pBS SK+ plasmiidi (10 ng) (teostatud juhendaja poolt) + 1 l 5 x ligeerimispuhvrit kokku 6 l + 1 l (5 ühikut) T4 DNA ligaasi (jääl) Selleks, et toimuks konkatemeersete DNA struktuuride moodustumine, peab [DNA] > 5 ng/l. (4) Inkubeeri toatemperatuuril kuni 24 h. Reaktsiooni võib alustada ka madalamal temperatuuril (näiteks 15 oC). Inkubeerimisaegadel lahendada allpool toodud lisaülesanne, vt lisamaterjale ja kuula juhendaja näpunäiteid. 2 Lisaülesanded (teoreetilised): 1
annaabi.ee 
