FADi abil kantakse glükoosi molekulilt kaks H aatomit hapnikule, selle tulemusel glükoos oksüdeerub glükoonhappeks ja tekib FADiga ekvimolaarses koguses vesinikperoksiidi. POD (doonor, H2O2-oksüdoreduktaas) osaleb reaktsiooni järgmises etapis. POD on samuti liitvalk (kromoproteiin), prosteetiliseks rühmaks on heem. POD katalüüsib spetsiifiliste substraatide oksüdeerumist (dehüdreerumist). H2O2 toimib vesiniku aktseptorina, redutsseruks H2O-ks. Kasutades kromogeenset substraati, saab reaktsiooni jälgida spektrofotomeetril. Töö käik: Määran glükoosisisaldust tundmatus proovis (greibimahl). Kasutan tööreaktiivi, mis sisaldab ensüüme GOD ja POD, kromogeenset substraati K3[Fe(CN)6] ja fosfaatpuhvrit pH väärtusega 6, sest reaktsioon toimub happelises keskkonnas. Töö reaktiiv on ettevalmistatud, materjalide kokkuhoiu mõttes. Uuritava proovi (greibimahla lahjendus) ettevalmistamine: Valmistasin greibimahlast 1:100 lahjenduse
oksüdeerub glükoonhappeks ja tekib FADiga ekvimolaarses koguses vesinikperoksiidi. · POD (doonor, H2O2-oksüdoreduktaas) osaleb reaktsiooni järgmises etapis. POD on samuti liitvalk (kromoproteiin), prosteetiliseks rühmaks on heem. · POD katalüüsib spetsiifiliste substraatide oksüdeerumist (dehüdreerumist). H2O2 toimib vesiniku aktseptorina, redutsseruks H2O-ks. · Kasutades kromogeenset substraati, saab reaktsiooni jälgida spektrofotomeetril. Töö käik: Määran glükoosisisaldust tundmatus proovis (mesi). Kasutan tööreaktiivi, mis sisaldab ensüüme GOD ja POD, kromogeenset substraati K3[Fe(CN)6] ja fosfaatpuhvrit pH väärtusega 6, sest reaktsioon toimub happelises keskkonnas. Töö reaktiiv on ettevalmistatud, materjalide kokkuhoiu mõttes. Töö reaktiivi koostis : (25 ml kolvis sisaldub) · 2,5 mg GOD · 1,5 mg POD
OH (HOCH) 4 + H2O 2 HO D-glükoonhape Reaktsiooni järgmises etapis osaleb POx, mis sisaldab prosteetilise rühmana heemi. POx katalüüsib spetsiifiliste substraatide oksüdeerumist (dehüdreerumist). Teine substraat H2O2 toimib seejuures kui vesiniku aktseptor, redutseerudes H2O -ks. Kasutades kromogeenset substraati, saab reaktsiooni hõlpsasti jälgida spektrofotomeetriliselt. Värvilise ühendi kontsentratsioon on võrdelises sõltuvuses glükoosisisalduses uuritavas proovis. Reaktsiooni põhimõtteline skeem: peroksüdaas Oksüdeeritud substraat värvusetu + H2O2 Taandatud substraat + H2O2
Tekkiv kaaliumheksatsüanoferraat(III), K3[Fe(CN)6] ehk punane veresool annab lahusele kollase värvuse ja on detekteeritav lainepikkusel 410 nm. Reaktsioon kulgeb POx-ile sobivas mõõdukalt happelises keskkonnas pH 6 juures. Töö käik Tööreaktiiv Glükoosisisalduse määramise ensümaatilise meetodi puhul on keskses rollis tööreaktiiv, mis sisaldab eelkirjeldatud ensüüme glükoosi oksüdaasi (GOx) ja peroksüdaasi (POx), kromogeenset substraati kaaliumheksatsüanoferraati(II) ja reaktsioonide kulgemiseks vajaliku keskkonna loomiseks fosfaatpuhvrit pH väärtusega 6,0. 25 ml tööreaktiivi valmistamiseks võetakse vastav mõõtekolb, millesse viiakse: 2,5 mg glükoosi oksüdaasi; 1,5 mg peroksüdaasi; 16,6 ml 0,2 M fosfaatpuhvrit, pH = 6,0; K4[Fe(CN)6] 0,1%-list lahust koguses, mis on vajalik kolvi täitmiseks kuni lõppmahuni. Kuni tarvitamiseni säilitatakse tööreaktiivi külmkapi temperatuuril.
värvuse ja on detekteeritav lainepikkusel 410 nm. Reaktsioon kulgeb POx-ile sobivas mõõdukalt happelises keskkonnas pH=6 juures. Peroksüdaas 2+ 2 Fe + H2O2 + 2 H+ 2 Fe3+ + 2 H2O Töö käik: Tööreaktiiv Glükoosisisalduse määramise ensümaatilise meetodi puhul on keskses rollis tööreaktiiv, mis sisaldab eelkirjeldatud ensüüme GOx ja POx, kromogeenset substraadi K4[Fe(CN)6] ja fosfaatpuhvrit pH väärtusega 6,0. Töötan ettevalmistatud reaktiiviga. Uuritava lahuse ettevalmistamine Tundmatuks prooviks on naturaalne apelsiinimahl. Pressin apelsiinist umbes 5 ml mahla, mida pärast vajalikul määral lahjendan. (1/200 ml). Selleks valan 200 ml-lise katseklaasi 1 ml apelsiinimahla ja lisan kriipsuni vett. Glükoosilahuste valmistamine Kindlakontsetratsiooniliste glükoosilahuste valmistamisel lähtutakse glükoosi standart-
POx katalüüsib Fe2+ oksüdatsiooni Fe3+-ks, millega kaasnevalt vesinikperoksiid redutseerub veeks. Tekkiv K3[Fe(CN)6] (punane veresool) annab lahusele kollase värvuse ja on detekteeriv lainepikkusel 410 nm. Reaktsioon kulgeb pH 6 juures. Töö käik: Käesoleva töö ülesandeks on glükoosisisalduse määramine mingis bioloogilises objektis, milleks mina kasutasin mett. Selleks kasutasin tööreaktiivi, mis sisaldas eelkirjeldatud ensüüme glükoosi oksüdaasi ja peroksüdaasi ja kromogeenset substraati K4[Fe(CN)6]. Uuritava lahuse (tundmatu proovi) ettevalmistamine Uuritava lahusena, milles glükoosi kontsentratsiooni määrama hakkasin, kasutasin mina mee tõmmist. Selleks kaalusin analüütilistel kaaludel purgist Mesi I 115,0 mg mett ja viisin kadudeta 200 ml mahuga mõõtekolbi. Seda tegin kuuma destilleeritud veega, mida lisasin väikeste portsionitena 3 korda kaaluklaasi, segasin klaasi sisu väikese metallpulgaga ja valasin tekkinud lahuse lehtri abil mõõtekolbi
Värvusetu Värviline Peroksüdaas 2 Fe2+ + H2O2 + 2 H+ 2 Fe3+ + 2 H2O Käesoleva töö ülesandeks on glükoosisisalduse määramine mingis bioloogilises objektis. Tööreaktiiv: Glükoosisisalduse määramise ensümaatilise meetodi puhul on keskses rollis tööreaktiiv, mis sisaldab eelkirjeldatud ensüüme glükoosi oksüdaasi (GOx) ja peroksüdaasi (POx), kromogeenset substraati kaaliumheksatsüanoferraati(II) ja reaktsioonide kulgemiseks vajaliku keskkonna loomiseks fosfaatpuhvrit pH väärtusega 6,0. 25 ml tööreaktiivi valmistamiseks võetakse vastav mõõtekolb, millesse viiakse: 2,5 mg glükoosi oksüdaasi; 1,5 mg peroksüdaasi; 16,6 ml 0,2 M fosfaatpuhvrit, pH = 6,0; K4[Fe(CN)6] 0,1%-list lahust koguses, mis on vajalik kolvi täitmiseks kuni lõppmahuni
FAD kaasabil kantakse glükoosi molekulilt 2 vesiniku aatomit hapnikule, mille tulemusena oksüdeerub glükoos glükoonhappeks ja tekib viimasega ekvimolaarses koguses vesinikperoksiidi. Reaktsiooni järgmises etapis osaleb POD, mis sisaldab prosteetilise rühmana heemi. POD katalüüsib spetsiifiliste substraatide oksüdeerumist (dehüdreerumist). Teine substraat H2O2 toimib seejuures kui vesiniku aktseptor, redutseerudes H2O-ks. Kasutades kromogeenset substraati, saab reaktsiooni hõlpsasti jälgida spektrofotomeetriliselt. Värvilise ühendi kontsentratsioon on võrdelises sõltuvuses glükoosisisalduses uuritavas proovis. Reaktsiooni põhimõttleine skeem: POD toimel oksüdeeruva kromogeense substraadina võib kasutada väga erinevaid keemilisi ühendeid. Üheks võimalikuks substraadiks on o- tolidiin, mille helesinine oksüdeeritud vorm on detekteeritav lainepikkusel 630 nm.
Käesoleva töö ülesandeks on glükoosisisalduse määramine mingis bioloogilises objektis, nagu mesi, puuviljad vm taimne materjal, mis töö lihtsustamise eesmärgil ei tohiks sisaldada märkimisväärsel hulgal värvaineid. POx-i substraadina kasutatakse antud töös kaaliumheksatsüanoferraat(II). Katse käik Tööreaktiiv Glükoosisisalduse määramise ensümaatilise meetodi puhul on kesksel kohal tööreaktiiv, mis sisaldab ensüüme POx ja GOx, kromogeenset substraati kaaliumheksatsüanoferraati(II) ja reaktsioonide kulgemiseks vajaliku keskkonna loomiseks fosfaatpuhvrit pH väärtusega 6,0. Töötasin ettevalmistatud tööreaktiiviga. Uuritava lahuse (tundmatu proovi) ettevalmistamine Uuritavaks lahuseks ehk tundmatuks prooviks, milles tuli määrata glükoosi kontsentratsioon, oli minu katse puhul sidrunimahl. Sidrunimahlast tuli valmistada 25-kordne lahjendus. Selleks pipeteerisin gradueeritud
R O PO3 2- + H2O = R- OH + HPO4 2- R tähistab mitmeid erinevaid ühendeid, nagu mono-, oligo- ja polüsaahariidid, mono-, oligo ja polünukleotiidid jt. Aluselised fosfataasid on looduses laialt levinud, kuid tavaliselt isoleeritakse seda ensüümi E.colist või veise soolestikust. Antud töös uuritakse veise soolestiku fosfataasi ensüümikineetikat. ALUSELISE FOSFATAASI AKTIIVSUSE MÄÄRAMINE Aluselise fosfataasi aktiivsuse määramiseks kasutatakse kromogeenset substraati p- nitrofenüülfosfaati (pNPP), mille hüdrolüüsi on võimalik kvantitatiivselt jälgida. Ensüümreaktsiooni käigus hüdrolüüsitakse pNPP p-nitrofenooliks ja anorgaaniliseks fosfaadiks. Protoneeritud vormis p-nitrofenool ei neela nähtavat valgust, kuid aluselises keskkonnas deprotoneeritud vormis (p-nitrofenolaat) neelab intensiivselt valgust lainepikkustel 400-415 nm (ekstinktsioonikoefitsient 410 = 18400 M-1cm-1). Kuivõrd pNPP
Reaktsioon kulgeb POx-ile sobivas happelises keskkonnas (pH=6). Töö käik Töö ülesanne Glükoosisalduse määramine mingis bioloogilises objektis (mesi, puuviljad jm), mis töö lihtsustamise eesmärgil ei sisalda palju värvaineid. POx-i substraadina kasutatakse kaaliumheksatsüanoferraat(II). Tööreaktiiv Keskses rollis glükoosisalduse määramise ensümaatilise meetodi puhul on tööreaktiiv, mis sisaldab eelkirjeldatud glükoosi oksüdaasi (GOx) ja peroksüdaasi (POx), kromogeenset substraati kaaliumheksatsüanoferraati(II) ja reaktsioonide kulgemiseks vajaliku keskkonna loomiseks fosfaatpuhvrit, mille pH on 6,0. Ensüümide kokkuhoiu eesmärgil oli tööreaktiiv ette valmistatud. Uuritava lahuse ettevalmistamine Minu uuritavaks lahuseks, mille glükoosisisaldust määrasin, oli apelsinimahl. Mahla pressisin apelsini lõigust välja. Võtsin saadud kogusest 1,5 ml, mille lahjendasin 200 ml destilleeritud veega
seda kõrgem on tema optiline tihedus ja seetõttu ka glükoosi sisaldus. Antud töös on substraadina kasutusel kaaliumheksatsüanoferraat(II) K 4[Fe(CN)6] ehk ajaloolise nimetusega kollane veresol. Tekkiv punane veresool K 3[Fe(CN)6] annab lahusele kollase värvuse ja on detekteeritav lainepikkusel 410 nm. Reaktsioon kulgeb happelises keskkonnas pH 6 juures. Töö käik Tööreaktiiv Juba valmisolev tööreaktiiv sisaldab ensüüme GOx ja POx, kromogeenset substraati K4[Fe(CN)6] ja fosfaatpuhvrit pH väärtusega 6,0. 25 ml tööreaktiivi valmistamiseks võetakse vastav mõõtekolb, millesse viiakse: 2,5 mg glükoosi oksüdaasi GOx 1,5 mg peroksüdaasi POx 16,6 ml 0,2 M puhverlahust K4[Fe(CN)6] 0,1%-list lahust, et täita kolb lõppmahuni. Tööreaktiivi tuleb säilitada külmkapi temperatuuril kuni tarvitamiseni. Meie reaktiiv oli juba laual valmis, kuna enne kasutamist pidi see taas soojenema toatemperatuurini.
- O-tolidiini oksüdeeritud vorm on helesinine, detekteeritav lainepikkusel 630 nm Glükoosisisalduse määramisel ei tohiks bioloogilises objektis lihtsustuse mõttes olla märkimisväärselt värvaineid. POx-i substraadina kasutatakse antud töös kaaliumheksatsüanoferraat (II). 3.3.2. Töö käik TÖÖREAKTIIVI ETTEVALMISTAMINE: Tööreaktiiv peab sisaldama glükoosi oksüdaasi (GOx) ja peroksüdaaso (POx), kromogeenset substraati kaaliumheksatsüanoferraat (II) ja vajalikku kk-a loomiseks fosfaatpuhvrit pH väärtusega 6,0. Tööreaktiivi valmistamine: 1. Võta 25 ml tööreaktiivi valmistamiseks vastav mõõtekolb 2. Vii sellesse 2,5 mg Gox-i 3. Lisa 1,5 mg Pox-i 4. Lisa 16,6 ml 0,2 M fosfaatpuhvrit, pH=6,0 5. Lisa K4[Fe(CN)6] 0,1%-list lahust kolvi kuni vajaliku mahuni täitmiseni. 6. Säilita külmkapi temperatuuril Minu uuritavaks lahuseks oli sidrunimahl. 7
Töö eesmärgiks on glükoosisisalduse määramine mingis bioloogilises objektis, antud juhul sidrunis. POx-i substraadina kasutatakse antud töös kaaliumheksatsüanoferraati(ll). TÖÖ KÄIK Tööreaktiiv Antud töös on kasutusel 25 ml-ne tööreaktiiv, mis sisaldab glükoosi oksüdaasi (GOx) (2,5 mg) ja peroksüdaasi (POx) (1,5 mg), reaktsioonide kulgemiseks vajaliku keskkonna loomiseks fosfaatpuhvrit (pH=6,0) (16,6 ml) ja kromogeenset substraati kaaliumheksatsüanoferraati(II) (lisatakse kuni lõppmahuni). Ensüümide kokkuhoiu eesmärgil ei valmista iga üliõpilane tööreaktiivi ise, vaid töötab ettevalmistatud tööreaktiiviga. Tööreaktiiv säilitatakse külmkapi temperatuuril. Uuritava lahuse ettevalmistamine Antud töös määrasin sidruni glükoosisisaldust. Selleks pressisin sidrunist natuke mahla välja. Praktikumi juhendajalt sain lahjendusmäära: 1 ml sidrunimahla 25 ml lahuses.
2+¿+ H 2 O 2+ 2 H ¿ ¿ 2 Fe Käesoleva töö ülesandeks on glükoosisisalduse määramine mingis bioloogilises objektis, nagu mesi, puuviljad või muu taimne materjal, mis töö lihtsustamise eesmärgil ei tohiks sisaldada märkimisväärsel hulgal värvaineid. POx-i substraadina kasutatakse antud töös. Töö käik Tööreaktiiv Glükoosisisalduse määramise ensümaatilise meetodi puhul on kesksel kohal tööreaktiiv, mis sisaldab ensüüme POx ja GOx, kromogeenset substraati kaaliumheksatsüanoferraati(II) ja reaktsioonide kulgemiseks vajaliku keskkonna loomiseks fosfaatpuhvrit pH väärtusega 6,0. Töötasin ettevalmistatud tööreaktiiviga. 25 ml tööreaktiivi koosnes: 2,5 mg glükoosi oksüdaasi 1,5 mg peroksüdaasi 16,6 ml 0,2 M fosfaatpuhvrit pH=6 K4[Fe(CN)6] 0,1% lahust koguses, mis on vajalik kolvi täitumist lõppmahuni Uuritava lahuse (tundmatu proovi) ettevalmistamine
sisaldada märkimisväärsel hulgal värvaineid. POx-i substraadina kasutatakse antud töös kaaliumheksatsüanoferraat(ll). 87 Töö käik Tööreaktiiv Glükoosisisalduse määramise ensümaatilise meetodi puhul on keskses rollis tööreaktiiv, mis sisaldab eelkirjeldatud ensüüme glükoosi oksüdaasi (GOx) ja peroksüdaasi (POx), kromogeenset substraati kaaliumheksatsüanoferraati(II) ja reaktsioonide kulgemiseks vajaliku keskkonna loomiseks fosfaatpuhvrit pH väärtusega 6,0. Ensüümide kokkuhoiu eesmärgil ei valmista iga üliõpilane tööreaktiivi ise, vaid töötab ettevalmistatud tööreaktiiviga. Kuna ensüümid võivad tööreaktiivi pikemaajalisel säilitamisel aktiivsust kaotada, siis tuleb tööreaktiivi valmistada väikeste portsjonite (25 või 50 ml) kaupa vahetult enne praktikumi.
annaabi.ee 
