0,1 μl 5 U/μl HotFIRE Pol Polümeraasi (lõppkonts. 0,5 U/μl) – katalüüsib PCRi, peab säilitama oma aktiivsust kõrgel temperatuuril. Taq polümeraasid ei oma proof- reading aktiivsust (3’ – 5’ exonukleaasset aktiivsust), seega neil puudub võime kord valesti lülitatud nukleotiidi õigega asendada. See on tähtis TA-kloneerimisel, kuna meil on vaja, et moodustaksid sobivad restriktsioonisaidid edasiseks kloneerimiseks, kus 3’ otsas on adeniin ja 5’ otsas on tümidiin ning vektori ja inserdi ligeerimisel toimub A-T otste paardumine. 2. Segasin kõik vortexiga, fuugisin ning asetasin segu PCRi masinasse. 3. PCRi programmi kirjutamine: 1. 95 °C 15 minutit – polümeraasi aktiveerimine 2. 95 °C 10 sekundit – DNA ahelate denatureerimine 3. 56 °C 20 sekundit – praimerite seondumine DNAle (annealing) 4. 72 °C 3 minutit – DNA süntees 5. Kordamine alates 2
ning PCR-i produktil on A-overhang otsad. T ja A on omavahel komplementaarsed, seega vektori ja inserdi ,,kleepuvad otsad" ühendatakse komplementaarsusprintsiibi alusel kõigepealt vesiniksidemetega, seejärel saab ligaas sünteesida fosfodiestersidemed. Polümeraasi valikul tuleb silmas pidada, et tegemist oleks Taq Polümeraasiga, mis lisab suure tõenäosusega 3' adeniini aluse, mis on vajalik T-A kloneerimiseks. c) Vektoril on kaks antibiootikumiresistentsust, seega rakke, kuhu plasmiid on transformeeritud, saab kasvatada nii ampitsilliini, kanamütsiini kui ka mõlemat sisaldavad keskkonnas seeläbi saab vähendada ohtu, et plasmiidi mitte sisaldavad rakud tekitavad saaste. Vektor sisaldab lacZ operoni, mis võimaldab kasutada inserti sisaldavate rakukolooniate tuvastamiseks sini-valge meetodit.
??! 52. Kuidas konstrueerida üht transgeenset looma? Lihtsalt 53. Mille poolest erineb transgeense looma ja transgeense taime konstrueerimine? Taime rakkudel on teatud kemikaalide mõjul võime dedifferentseeruda. Mis tõttu võib ükskõik millisest taime osast saada uue organismi. Loomade puhul nii teha (veel) ei saa. 54. Mille poolest erineb organismide kloneerimine DNA kloneerimisest? DNA´d saab kloneerida katseklaasis vajalike komponentide juuresolekul, Organismi kloneerimiseks, tuleb kõigepealt kloneerida organismi DNA ja siis see uude rakku sisestada(munarakku) mis uueks organismiks areneb. 55. Tüvirakud. Rakud, millel on võime differenseeruda ükskõik millisteks organismi rakkudeks ja kudedeks. 56. Geeniteraapia. Vaata punkti 36 57. Miks tekib organismis vähkkasvaja. A cell's ability to instruct itself to die, a process called apoptosis <- see süsteem on nässus + 4-5samaaegset erinevat mutatsiooni raku geenides. 58
kuid BAC vektorid sisaldavad bakterite replikatsiooni molekulaarseid komponente. YAC on valmistatud pärmi kromosoomi spetsiifiliste piirkondade põhjal ning BAC toodetud F-plasmiidi põhjal. YAC on lineaarne fragment, kuid BAC sirkulaarne. YAC and BAC vectors are two types of artificial vector systems designed to clone large genomic DNA fragments. They have multiple applications in the preparation of genomic and cDNA libraries. 15. Kirjelda kloneerimise protseduuri. Mis on kloneerimiseks hädavajalikud komponendid ning tingimused? Geeni kloonimine (ingl. gene cloning) eeldab mitut järjestikust protseduuri, milledeks on uuritava geeni: 1) isoleerimine; 2) viimine isereplitseeruvasse geneetilisse elementi (plasmiidi või viirusgenoomi); 3) amplifikatsioon ehk paljundamine; 4) uuritava geeniga rekombinantsete kloonide selektsioon. 16. Mis on geeniraamatukogud? 1:43. Geeniraamatukogu on bakteri või faagikloonide kogumid millest iga kloon sisaldab meid huvitavast
• GM-lehma piimas laktoalbumiin enneaegsetele lastele • GM-sead toodavad inimese hemoglobiin • lehm kes toodab insuliini Geneetiliselt muundatud mikroorganismide kasutusalad. nt kasutatakse transgeenseid pärme rekombinantsete valkude tootmiseks (bhepatiidi vaktsiin) ja juustu tootmiseks ensüüme.Viiruseid kasutatakse geeniteraapias. Bakterid toodavad erinevaid valke haiguste raviks (insuliin, inimese kasvuhormoon, vere hüübimis faktorid). DNA kloneerimiseks kasutatakse baktereid. Saab kasutada keskkonna tehnoloogias, saaste eemaldamine. Mis on nokaut hiir? Nokout organism- organism kellel on teatud geen maha surutud. Geeneetiliselt muundatud hiir, kus teadlased on välja lülitanud olemasoleva geeni, seda asendades või segades seda mingi teise DNAga. Ühe geeni välja lülitamisega saab uurida seda, mida see geen tavaliselt teeb. Knockout-hiir või knock-out hiir on geneetiliselt muundatud hiir milles teadlased on
Rakud lüüsitakse puhvris, mis sisaldab SDS-i (lahustab rakumembraanid), NaCl, EDTA-d (inhibeerib nukleaase) ja proteinaas K-d (lagundab valgud) pidevalt segades 37°C või 55°C juures. DNA sadestatakse isopropanooliga või etanooliga, mille tulemusena tekkib lahusesse DNA pundar, mille saab otsiku abil tõsta puhtasse tuubi. DNA lahustamiseks kasutatakse enamasti Tris-HCl puhvrit EDTA-ga. DNAd saab edasi kasutada genotüüpiseerimiseks, mingite lõikude amplifitseerimiseks, kloneerimiseks jne. RNA eraldamine imetajarakkudest RNA eraldamiseks kasutatakse tänapäeval enamasti spetsiaalseid komplekte ehk kitte. Võib kasutada ka Trizol vms. reagenti, mille põhimõte on RNA ekstraheerimine guanidiin- isotiotsüanaadi ja fenool-kloroformiga. Kasutatakse ka vedelat lämmastikku. RNA eraldamisel on väga oluline hoida puhtust, sest RNAaase on peaaegu igal pool ja RNA laguneb suhteliselt kergesti.
kasvatada rakke 2,4-diklorofenoksüäädikhappe 2,4-D juuresolekul, mis on üks taimehormoone, taime koerakud dediferentseeruvad, moodustades kalluse. Seejärel viiakse kalluskultuuri rakud 2,4-D-vabale söötmele, mis sisaldab kasvuhormooni kinetiin, ning taimerakud hakkavad jälle diferentseeruma. 54. Mille poolest erineb organismide kloneerimine DNA kloneerimisest? DNA´d saab kloneerida katseklaasis vajalike komponentide juuresolekul, Organismi kloneerimiseks, tuleb kõigepealt võtta kloneeritava organismi mingi rakku tuum ja siis see naise munarakku sisestada (eelnevalt on sealt tuum eemaldatud) ja siis see peremees organismi panna (naise vagiinasse) kus see uueks organismiks areneb. 55. Miks on oluline teada organismide genoomide täispikki järjestusi? Tänu geenijärjestamise tehnoloogia täiustumisele loodavad teadlased loomade DNA kaudu jõuda lähemale
Kloneerimise vektor kunstlik DNA molekul, mis on võimeline mingis organismis paljunema (tavaliselt vektor plasmiid, organism aga mikroob). Viia rekombinantne DNA vektoriga organismi kus ta antakse edasi paljunemise käigus järglaspõlvkonnale. Plasmiidid: Plasmiid on bakteritele iseloomulik ekstrakromosomaalne rõngasjas, kahe- ahelaline DNA molekul, mis on võimeline ise autonoomselt rakus replitseeruma. Plasmiidseid vektoreid kasutatakse siis kloneerimiseks, sest sinna on võimalik kergesti sisse viia võõras DNA, ja plasmiid paljuneb autonoomselt. Plasmiidil peavad aga olema teatud omadused: Esmalt ori sait, mis on vajalik replikatsiooniks. Plasmiid peab kandma mingit spetsiifilist tunnust, et eristada plasmiidiga mikroobe nendest, millel plasmiide ei ole (tavaliselt mingi antibiootikumi suhtes resistentsuse geen, nii et saame antibiootikumiga söötmel kasvatada vaid plasmiidiga mikroobe). Unikaalne
liikumine RNA-lt valgule on aga alati ühesuunaline. Rekombinantse DNA tehnoloogia Kaasajal kasutatakse geenide molekulaarseks analüüsiks rekombinantse DNA tehnoloogiat. Tehnoloogia põhineb DNA fragmentide isoleerimisel genoomist ning viimisel väikestesse, rakus iseseisvalt replitseeruvatesse DNA molekulidesse kloneerimisvektoritesse, mis võimaldavad rekombinantset DNA- d paljundada, saada selle paljundamisel koopiaid e. kloone. Vastavat protseduuri nimetatakse geenide kloneerimiseks. Kloneerimisel on mitmeid rakendusi: 1) DNA primaarjärjestuse määramine e. sekveneerimine 2) geeni(de) avaldumise regulatsiooni uurimine 3) geenide poolt kodeeritud valkude funktsioonide uurimine 4) geenitehnoloogia 1 Paljude kloneerimisvektorite konstrueerimisel on kasutatud bakteriofaagide genoomi ja bakterite kromosoomiväliseid elemente - plasmiide
liikumine RNA-lt valgule on aga alati ühesuunaline. Rekombinantse DNA tehnoloogia Kaasajal kasutatakse geenide molekulaarseks analüüsiks rekombinantse DNA tehnoloogiat. Tehnoloogia põhineb DNA fragmentide isoleerimisel genoomist ning viimisel väikestesse, rakus iseseisvalt replitseeruvatesse DNA molekulidesse kloneerimisvektoritesse, mis võimaldavad rekombinantset DNA- d paljundada, saada selle paljundamisel koopiaid e. kloone. Vastavat protseduuri nimetatakse geenide kloneerimiseks. Kloneerimisel on mitmeid rakendusi: 1) DNA primaarjärjestuse määramine e. sekveneerimine 2) geeni(de) avaldumise regulatsiooni uurimine 3) geenide poolt kodeeritud valkude funktsioonide uurimine 4) geenitehnoloogia Paljude kloneerimisvektorite konstrueerimisel on kasutatud bakteriofaagide genoomi ja bakterite kromosoomiväliseid elemente - plasmiide. Need võimaldavad huvipakkuvat DNA-d paljundada ja selles
annaabi.ee 
