sadestamisele lõpetab TKÄ ka ensüümireaktsiooni kulgemise. Lahusesse jäävad vaid vabad aminohapped ja madalmolekulaarsed peptiidid, mille kontsentratsiooni iseloomustatakse kaudselt aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete (türosiin, trüptofaan, fenüülalaniin) sisalduse alusel. Need aminohapped omavad neeldumismaksimume lainepikkustel 270- 280nm, kaseiini hüdrolüüsi produktide sisaldus väljendatakse türosiini kontsentratsioonina. Kasutades olemasolevat kaliibrimissirget leitakse absorbtsiooni väärtuste järgi türosiini kontsentratsioon kindlatel aegadel reaktsioonisegust võetud proovides. Töö käik Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine · Uuritava proteaasi lahusena kasutatakse alkalaasi (leelisproteaas, pH 8,4) · Alkalaasi kaaluti analüütilisel kaalul 7,6 mg (soovitatav oli 7,5 mg) ja tehti sellest 5 ml lahust boraatpuhvris (pH 8,4) · Lahus tehakse 10 ml graduleeritud katseklaasi Ensüümireaktsiooni läbiviimine
spektrofotomeetrilisel meetodil. Reaktsioonisegust võetud proovides mõõdetaksegi kindla lainepikkusega valguskiirguse neelduvust uuritavas lahuses. Ehkki mõõdetav absorptsioon on tingitud kõikidest lahuses olevatest, aromaatset tuuma sisaldavatest aminohapetest, väljendatakse kaseiini hüdrolüüsi produktide sisaldus türosiini kontsentratsioonina mg /ml või mol /ml (1 mol = 181g = 0,181 mg). Kasutades olemasolevat kaliibrimissirget A (D) versus CTyr leitakse absorbtsiooni väärtuste järgi türosiini kontsentratsioon kindlatel aegadel reaktsioonisegust võetud proovides. Töö käik · Kaalusin 0.0076 g tahke proteaasi (alealase) preparaati, valasin selle gradueeritud katseklaasi ning lisasin vajaliku koguse puhvrit, et lahuse üldmaht oleks 5 ml. Segasin lahust proteaasi lahustumiseks 5 minuti vältel.
spektrofotomeetrilisel meetodil. Reaktsioonisegust võetud proovides mõõdetaksegi kindla lainepikkusega valguskiirguse neelduvust (= absorptsiooni = optilist tihedust, tähis A või D) uuritavas lahuses. Ehkki mõõdetav absorptsioon on tingitud kõikidest lahuses olevatest, aromaatset tuuma sisaldavatest aminohapetest, väljendatakse kaseiini hüdrolüüsi produktide sisaldus türosiini kontsentratsioonina mg /ml või mol /ml (1 mol = 181g = 0,181 mg). Kasutades olemasolevat kaliibrimissirget A (D) versus CTyr leitakse absorbtsiooni väärtuste järgi türosiini kontsentratsioon kindlatel aegadel reaktsioonisegust võetud proovides. Töö käik Kaalusin 0.02 g tahke proteaasi (esperaas) preparaati, valasin selle gradueeritud katseklaasi ning lisasin vajaliku koguse puhvrit, et lahuse üldmaht oleks 5 ml. Segasin lahust proteaasi lahustumiseks 5 minuti vältel. Samal ajal pipeteerisin suurde katseklaasi 25 ml 2% kaseiini lahust ning panin selle 10 minutiks termostaati
TKÄ ka ensüümireaktsiooni kulgemise. Lahusesse jäävad vaid vabad aminohapped ja madalmolekulaarsed peptiidid, mille kontsentratsiooni iseloomustatakse kaudselt aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete (türosiin, trüptofaan, fenüülalaniin) sisalduse alusel. Need aminohapped omavad neeldumismaksimume lainepikkustel 270-280 nm, kaseiini hüdrolüüsi produktide sisaldus väljendatakse türosiini kontsentratsioonina. Kasutades olemasolevat kaliibrimissirget leitakse absorbtsiooni väärtuste järgi türosiini kontsentratsioon kindlatel aegadel reaktsioonisegust võetud proovides. Töö käik Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine • Uuritava proteaasi lahusena kasutatakse alkalaasi. • Alkalaasi kaaluti analüütilisel kaalul 17,9 mg ja tehti sellest 5 ml lahust boraatpuhvris (pH 8,4) gradueeritud katseklaasi Ensüümireaktsiooni läbiviimine
spektrofotomeetrilisel meetodil. Reaktsioonisegust võetud proovides mõõdetaksegi kindla lainepikkusega valguskiirguse neelduvust (= absorptsiooni = optilist tihedust, tähis A või D) uuritavas lahuses. Ehkki mõõdetav absorptsioon on tingitud kõikidest lahuses olevatest, aromaatset tuuma sisaldavatest aminohapetest, väljendatakse kaseiini hüdrolüüsi produktide sisaldus türosiini kontsentratsioonina mg /ml või mol /ml (1 mol = 181g = 0,181 mg). Kasutades olemasolevat kaliibrimissirget A (D) versus CTyr leitakse absorbtsiooni väärtuste järgi türosiini kontsentratsioon kindlatel aegadel reaktsioonisegust võetud proovides. Töö käik Kaalusin 0.005 g tahke proteaasi (amülaasi) preparaati, valasin selle gradueeritud katseklaasi ning lisasin vajaliku koguse puhvrit, et lahuse üldmaht oleks 5 ml Segasin lahust proteaasi lahustumiseks 5 minuti vältel. Samal ajal pipeteerisin suurde katseklaasi 25 ml 2% kaseiini lahust ning panin selle 10 minutiks termostaati
Reaktsioonisegust võetud proovides mõõdetaksegi kindla lainepikkusega valguskiirguse neelduvust (= absorptsiooni = optilist tihedust, tähis A või D) uuritavas lahuses. Ehkki mõõdetav absorptsioon on tingitud kõikidest lahuses olevatest, aromaatset tuuma sisaldavatest aminohapetest, väljendatakse kaseiini hüdrolüüsi produktide sisaldus türosiini kontsentratsioonina mg /ml või mol /ml (1 mol = 181g = 0,181 mg). Kasutades olemasolevat kaliibrimissirget A (D) versus CTyr leitakse absorbtsiooni väärtuste järgi türosiini kontsentratsioon kindlatel aegadel reaktsioonisegust võetud proovides. Töö käik Puhvri valmistamine: Kaalusin 0,12 g boorhapet lisades dest vett kuni 10 ml. Kaalusin 0,19 g booraksit lisades vett kuni 10 ml. Väikese keeduklaasi pipeteerisin 5,5 ml boorhappe lahust ja 4,5 ml booraksi lahust. Kontrollisin lahuse pH ja sain 8,6, mis vastab nõutele. Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine:
peptiidid nende kontsentratsioon määratakse kaudselt aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete sisalduse algusel. Aromaatset tuuma sisaldavad aminohapped nagu Tyr, Trp ja Phe omavad neeldumismaksimume UV-piirkonnas lainepikkusel 270-280 nm ning selle tõttu on nad kergesti tuvastatavad spektrofotomeetriliselt. Antud katses väljendatakse kaseiini hüdrolüüsiproduktide sisaldus türosiini kontsentratsiooniga. Kasutades kaliibrimissirget, leitakse absorbtsiooni väärtuse järgi türosiini kontsentratsioon. Töö käik Ensüümpreparaadist töölahuse valmistamine Valmistada proteaasi preparaadist sobiva pH väärtusega puhvris lahus, ensüümi (antud juhul alkalaas) kontsentratsioon peaks olema lahuses 1-5 mg/ml, antud katses oli ensüümi kontsentratsiooniks 1,56 mg/ml (kaalutis 7,8mg). Kui ensüümpreparaadile on väike kogus puhverlahust lisatud, segada lahust klaaspulgaga u 5 min, kuni ensüüm lahustub
iseloomustatakse kaudselt aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete sisalduse kaudu. Aromaatse tuumaga aminohapped türosiin, trüptofaan ja fenüülalaniin omavad neeldumismaksimume UV-piirkonnas lainepikkustel 270-280 nm ja seetõttu saab neid hästi detekteerida spektrofotomeetriliselt. Proovides mõõdetakse kindlal lainepikkusega valguskiirguse neelduvust. Kaseiini hüdrolüüsi produktide sisaldus väljendatakse türosiini kontsentratsioonina mg/ml. Kasutades kaliibrimissirget saadakse optiliste tiheduste kaudu türosiini kontsentratsioon kindlatel ajahetkedel reaktsioonisegust võetud proovidel. 2. Töö käik Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine Uuritavast proteaasi preparaadist, milleks antud töös oli savinaas, valmistati ensüümile sobiva pH väärtusega puhvris lahus, mille kontsentratsioon oli 1,5 mg/ml. Arvutasin savinaasi kaalutise suuruse, milleks oli 0,0075 grammi. Kaalusin analüütilistel kaaludel
iseloomustatakse kaudselt aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete (türosiin, trüptofaan, fenüülalaniin) sisalduse alusel. Need aminohapped omavad neeldumismaksimume UV- piirkonnas lainepikkustel 270–280 nm, tänu millele on nad spektrofotomeetriliselt hõlpsalt detekteeritavad. Kaseiini hüdrolüüsi produktide sisaldust väljendatakse türosiini kontsentratsioonina mg/ml või µmol/ml, kusjuures 1 µmol = 181µg = 0,181 mg. Kasutades olemasolevat kaliibrimissirget leitakse absorbtsiooni väärtuste järgi türosiini kontsentratsioon kindlatel aegadel reaktsioonisegust võetud proovides Töö käik Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine Alkalaasi preparaadist valmistasin ensüümile sobiva pH väärtusega puhvris lahuse. Arvutasin, et 5 ml lahuse valmistamiseks on vaja 10 mg alkalaasi preparaati. Analüütilisel kaalul sain kaalutiseks 10,7 mg. Viisin ensüümipreparaadi kadudeta katseklaasi. Lisasin 5 ml
Lahusesse jääb vaba triloon B. Keetmisel 2 toimuv reaktsioon: Kasutades 0,02 M vasksulfaadi lahust määratakse vabanenud triloon B koguse tiitrimise teel.Selle käigus komplekseerub vabanenud triloon B uuesti Cu(II)-ioonidega ja kompleksi taastekkimine on täheldatav lahusesse lisatud indikaatori mureksiidi värvuse muutumise järgi. Tiitrimisel toimuv reaktsioon: Tiitrimiseks kulunud CuSO4 lahuse hulga järgi ja kaliibrimissirget kasutades leitakse taandavate suhkrute kontsentratsioon reaktsioonisegus. Invertaasi aktiivsus avaldatakse tahke preparaadi puhul mikrokatalites 1g kohta kat/g. 3 Töö käik Ensüümpreparaadist töölahuse valmistamine Lahustina kasutasin atsetaatpuhvrit pH väärtusega 4,8. Tahke invertaasi preparaadi puhul jääb sobiv ensüümi kontsentratsioon lahuses 1 ja 5 mg/ml vahemikku.
line lahus 7. Milline roll on K4Fe(CN)6 tööreaktiivis? Kas ja millega võinuks teda asendada? Tema oksüdatrsiooni käigus tekkiv ühend on värviline (kollane) ja see võimaldab määrata optilist tihedust. Oleks võinud asendada ka mõnda bensidiini derivaadiga. 8. Milline keskkonna pH väärtus on sobiv GOx-i ja POx-i toimimiseks ja kuidas see tagati? Optimaalne ph on 6.0, mis tagati fosfaatpuhvri abil, mida kasutati tööreaktiivi valmistamisel. 9. Milleks oli antud töös vaja kaliibrimissirget ja kuidas toimisite, et kaliibrimissirget koostada? Kalibreerimisgraafik oli vajalik, et määrata glükoosisisaldus uuritavas lahuses. Selleks tehti kindla glükoosisisaldusega lahused, lasti ensüümil neid oksüdeerida ja määrati vastavad optilised tihedused. 10. Oletagem, et glükoosi kontsentratsioon 200 korda lahjendatud viinamarjamahlas on 0,5 mg/ml. Mitu massi% glükoosi sisaldub selles mahlas? Eeldagem, et mahla tihedus d =1,0 g/cm3? X = C L 10-3 d 100
Reaktsioonisegust võetud proovides mõõtsin kindla lainepikkusega valguskiirguse neelduvust ( = absorptsiooni = optilist tihedust, tähis A või D) uuritavas lahuses. Ehkki mõõdetav absorbtsioon on tingitus kõikidest lahuses olevatest, aromaatset tuuma sisaldavatest aminohapetest, väljendatakse kaseiini hüdrolüüsi produktide sisaldus türosiini kontsentratsioonia mg/ml või µmol/ml. Kasutasin olemasolevat kaliibrimissirget A versus CTyr leidsin absorbtsiooni väärtuse järgi türosiini kontsentratsiooni kindlatel aegadel reaktsioonisegust võetud proovides. 2. Töö käik 1.3 Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine Minu uuritav preparaat oli alkanaas. Valmistasin uuritavast preparaadist ensüümile sobiva pH väärtusega puhvris lahus, milles ensüümi kontsentratsioon oli 1,5 mg/ml.Valmistasin 5 ml töölahust
Reaktsioonisegust võetud proovides mõõdetakse kindla lainepikkusega valguskiirguse neelduvust uuritavas lahuses. Kasutades olemasolevat kaliibrimissirget leitakse absorbtsiooni väärtuste järgi türosiini kontsentratsioon kindlatel aegadel reaktsioonisegust võetud proovides. Töö käik: Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine · Uuritavast proteaasi preparaadist valmistatakse ensüümile sobiva pH väärtusega puhvris lahus, milles ensüümi kontsentratsioon on vahemikus .
sellele on nad spektrofotomeetriliselt hõlpsasti detekteeritavad. Reaktsioonisegust võetud proovides mõõdetaksegi kindla lainepikkusega valguskiirguse neelduvust uuritavas lahuses. Ehkki mõõdetav absorbtsioon ( opiline tihedus, A) on tingitud kõikidest lahuses olevatest, aromaatset tuuma sisaldavatest aminohapetest, väljendatakse kaseiini hüdrolüüsi produktide sisaldus türosiini kontsentratsioonina mg /ml või mol /ml (1 mol = 181g = 0,181 mg). Kasutades olemasolevat kaliibrimissirget A versus CTyr leitakse absorbtsiooni väärtuste järgi türosiini kontsentratsioon kindlatel aegadel reaktsioonisegust võetud proovides. Töö käik Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine Uuritavast proteaasi preparaadist (esperaas) valmistatakse ensüümile sobiva pH väärtusega puhvris lahus, milles ensüümi kontsentratsioon on 4 mg/ml. Puhvri (boraatpuhver), lahuse täpse mahu (5 ml) ja ensüümi kontsentratsiooni järgi arvutatakse välja ensüümipreparaadi
peptiidid, mille kontsentratsiooni saab kaudselt iseloomustada aromaatset tuuma sisaldavate amh-te sisalduse alusel Aromaatset tuuma sisaldavad aminohapped: 1. Tyr (türosiin) 2. Trp (trüptofaan) 3. Phe (fenüülalaniin) Kaseiini hüdrolüüsi produktide sisaldust väjendatakse türosiini kontsentratsioonina mg/ml või mol/ml (1 mol= 181 g=0,181 mg). Kui kasutada kaliibrimissirget A vs CTyr leitakse absorbtsiooni väärtuste järgi türosiini kontsentratsioon kindlatel aegadel reaktsioonisegust võetud proovides. 3.2.2 Töö käik ENSÜÜMPREPARAADIST TÖÖLAHUSE VALMISTAMINE: 1. Valmista uuritavast protaasi preparaadist (ALKALAAS) ensüümile sobiva pH väärtusega puhvris lahus. NB! Ensüümi kontsentratsioon olgu vahemikus 1-5 mg/ml 2. Kooskõlasta juhendajaga: · Alkalaasile sobiv puhver Boraatpuhver, pH= 8,4 · Lahuse täpne maht 5 ml
Tekkiv kaaliumheksatsüanoferraat(III), K3[Fe(CN)6] ( punane veresool) annab lahusele kollase värvuse ja on detekteeritav lainepikkusel 410 nm. POx-i toimel oksüdeeruva kromogeense substraadina kasutatakse mitmeid bensidiini derivaate, nagu diaminobensidiini, tetrametüülbensidiini, samuti 2-tolidiini ehk o-tolidiini jt 8. Milline keskkonna pH väärtus on sobiv GOx-i ja POx-i toimimiseks ja kuidas see tagati? fosfaatpuhvrit pH väärtusega 6,0 9. Milleks oli antud töös vaja kaliibrimissirget ja kuidas toimisite, et kaliibrimissirget koostada? Kaliibrimisgraafiku koostamine on vaja glükoosi kontsentratsiooni kindlakstegemiseks 29 Kaliibrimisgraafik koostatakse standardlahuse lahjendamisel saadud kindla glükoosi kontsentratsiooniga proovide (katseklaasid 4, 5, 6) absorbtsiooni (optilise tiheduse) väärtuste alusel
Kui kasutatav kolonn on eelnevalt kaliibritud valkudega, milliste molekulmassid on teada, siis on võimalik uuritavas proovis sisalduvat valku molekulmassi järgi kindlaks teha. Olgu näiteks toodud variant, kus uuritava segu lahutamine on läbiviidud Sephadex G-100 kolonnis. Valkude jaoks on selle geeli eksklusioonipiirkond umbes 100 000. Sellisel juhul saab uuritavas segus sisalduva tundmatu valgu identifitseerimiseks kasutada tabelis esitatud andmete alusel ehitatud kaliibrimissirget, mille x-teljel on siintoodud valkude (standardvalkude) Rf väärtused ja y-teljel log Mr. Valkude jaotumine Sephadex G-100 kolonnis Valk Molekumass (Mr, kDa) Rf väärtus Veise albumiin 69 0,21 Ovalbumiin 43 0,32 Kümotrüpsinogeen A 25 0,48
annaabi.ee 
