Nad väljuvad minimaalse elueerimismahuga Vx min, mis on võrdne kolonni graanulitevahelise vedeliku mahuga: Vx min=Vv. Kõige aeglasemalt ja maksimaalse elueerimismahuga Vx max, väljuvad molekulid, mis on küllalt väikesed, et täielikult difundeeruda geeli pooridesse. Kromatografeerimise võib lugeda lõpetatuks, kui kolonni läbinud vedeliku üldmaht ületab kolonni kogumahu: Vx max Vt Vx max saab ka arvutada, teades geelimaatriksi mahtu: Vx max=Vt Vg 1 Neid aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda kasutatava geeli pooridesse ja mille elueerimismaht Vx on kindlaks määratud, iseloomustatakse liikumisteguriga: Töö käik Kõigepealt mõõdeti täidise kõrgus L ja diameeter d, millest lähtudes arvutati täidise kogumaht Vt. Siis arvutati geelimaatriksi maht Vg = k Vt ning Vxmax = Vt Vg. Fraktsioonide
Eluendi lisamine kolonni ja eluaadi fraktsioonide kogumine toimub käsitsi. Ainehulkade kindlakstegemiseks kogutud fraktsioonides kasutatakse spektrofotomeetrit. Töö käik Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine · Kontrollitakse, et kolonn oleks vertikaalne. · Märgitakse üles kasutatava kolonni täidiseks oleva Sephadex'i mark ja seda iseloomustav tegur k. · Mõõdetakse geelisamba kõrgus L ja ja diameeter d. · Arvutatakse täidise kogumaht Vt · Arvutatakse geelimaatriksi maht Vg = k · Vt ja sellest lähtuvalt kolonni iseloomustav maksimaalne elueerimismaht Vxmax=Vt - Vg · Arvutatakse fraktsioonide üldarv n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml; seega n = Vxmax / 2. · Statiivi pannakse vajalik kogus kalibreeritud ja nummerdatud katseklaase. · Märgitakse üles voolutuslahus ja varustatakse end sobiva pipetiga, millega saab lahust kolonni lisada. · Varutakse väike keeduklaas, kuhu lastakse alguses täidise pinnal olev eluent.
Liiga suured molekulid ei mahu graanulitesse ja väljuvad kolonnist esimesena, st nad on minimaalse elueerimismahuga ja on võrdsed graanulitevahelise vedeliku mahuga. Vxmin = Vv Väiksed molekulid suudavad difundeeruda geeli pooridesse ja liiguvad kolonnis kõige aeglasemini. Nad on maksimaalse elueerimismahuga on arvväärtuselt lähedased kolonni kogumahule. Vxmax = Vt Seda saab arvutada ka geelimaatriksi mahu abil Vxmax = Vt - Vg Aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda geeli pooridesse ja mille elueerimismaht on antud kolonnis kindlaks määratud, iseloomustatakse liikuvusteguriga Rf. Rf = (Vx Vxmin)/(Vxmax Vxmin) , kus 0 < Rf < 1 Fraktsioonides sisalduva aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vahelist graafilist sõltuvust nimetatakse kromatogrammi. Käesolevas töös kasutatakse
kolonni ja eluaadi fraktsioonide kogumine toimub käsitsi. Ainehulkade kindlakstegemiseks kogutud fraktsioonides kasutatakse spektrofotomeetrit. Töö käik Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine 1. Kontrollitakse, et kolonn oleks vertikaalne. 2. Märgitakse üles kasutatava kolonni täidiseks oleva Sephadex’i mark ja seda iseloomustav tegur k. 3. Mõõdetakse geelisamba kõrgus L ja ja diameeter d. 4. Arvutatakse täidise kogumaht Vt 5. Arvutatakse geelimaatriksi maht Vg = k • Vt ja sellest lähtuvalt kolonni iseloomustav 6. maksimaalne elueerimismaht Vxmax=Vt - Vg 7. Arvutatakse fraktsioonide üldarv n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml; seega 8. n = Vxmax / 2. 9. Statiivi pannakse vajalik kogus kalibreeritud ja nummerdatud katseklaase. 10. Märgitakse üles voolutuslahus ja varustatakse end sobiva pipetiga, millega saab lahust kolonni lisada. 11
pooridesse, siis väljuvad nad kolonnist esimesena, neil on minimaalne elueerimismaht Vxmin, mis võrdub kolonni vaba mahuga. Vxmin = Vv Ained, mille molekulmass on küllalt väike, et difundeeruda täielikult geeli pooridesse, liiguvad kolonnis aeglaselt ja väljuvad maksimaalse elueerimismahuga Vxmax, mis on lähedane antud kolonni kogumahule. Kromatografeerimise võib lugeda lõpetatuks, kui kolonni läbinud vedeliku maht ületab kolonni kogumahu. Teades geelimaatriksi mahtu Vg, võib Vxmax arvutada: Vxmax = Vt - Vg Geelkromatograafiat iseloomustavad kaks olulist parameetrit: Vv(=Vxmin)- vaba maht e eluaadi maht, millega väljuvad molekulid, mis antud geeli pooridesse ei mahu; Vxmax - maksimaalne elueerimismaht, eluaadi maht, mille juures väljuvad need molekulid, mis on võimelised graanulitesse täielikult sisenema. Kui aine molekulid mahuvad geeli pooridesse sisenema, siis iseloomustatakse nende
väljuvad nad kolonnist esimesena, st neil on minimaalne elueerimismaht Vx min, mis võrdub kolonni vaba mahuga. Vxmin= Vv Ained, mille molekulmass on küllalt väike, et täielikult difundeeruda geeli pooridesse, liiguvad kolonnis aeglaselt ja väljuvad maksimaalse elueerimismahuga Vx max, mis on lähedane antud kolonni kogumahule. Vxmax= Vt Kromatografeerimise võib lugeda lõpetatuks, kui kolonni läbinud vedeliku maht ületab kolonni kogumahu. Teades geelimaatriksi mahtu Vg, võib Vxmax arvutada: Vxmax= Vt-Vg Geelkromatograafiat iseloomustavad kaks olulist suurust: · Vv(=Vxmin)- vaba maht e. eluaadi maht, millega väljuvad molekulid, mis antud geeli pooridesse ei mahu · Vxmax- maksimaalne elueerimismaht, eluaadi maht, mille juures väljuvad need molekulid, mis on võimelised graanulitesse täielikult sisenema Kui aine molekulid mahuvad geeli pooridesse, siis iseloomustatakse nende liikumist kolonnis
vedeliku mahuga Vv. Vxmin = Vv Ained, mille molekulmass on küllalt väike, et täielikult difundeeruda geeli pooridesse, liiguvad kolonnis kõige aeglasemalt ja väljuvad maksimaalse elueerimismahuga V xmax, milline on arvväärtuselt lähedane kasutatava kolonni kogumahule V t. Vxmax = Vt. Kromatografeerimise protsess on lõppenud, kui kolonnist väljunud vedeliku (eluaadi) üldmaht võrdub ligikaudu kolonni kogumahuga. Kui geelimaatriksi maht Vg on teada, siis vib arvutada maksimaalse elueerimismahu Vxmax = Vt Vg Kasutatava geelkromatograafia kolonni iseloomustamiseks on vaja teada kolonni vaba mahtu Vv (= Vxmin) ja maksimaalset elueerimismahtu Vxmax. Neid aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda kasutatava geeli pooridesse iseloomustatakse liikuvusteguriga Rf, mis arvutatakse vastavalt valemile: Rf = (Vx Vxmin) / (Vxmax Vxmin) Rf arvväärtused jäävad vahemikku 0....1.
2. Töö käik 1.3 Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine Kontrollisin kolonni vertikaalsust. Märkisin üles kasutatava kolonni täidiseks oleva Sephadex'i margi ja seda iseloomustava teguri k. Sephadex'i mark: G-75 k = 0,1 Mõõtsin geelisamba ehk täidise kõrguse L ja diameetri d, kasutades sobivat joonlauda. L = 17,6 cm d = 3 cm Arvutasin täidise kogumahu Vt. Vt = L * r2 * = 17,6 * 1,52 * = 124,4 cm3 Arvutasin geelimaatriksi mahu Vg = k · Vt ja sellest lähtuvalt kolonni iseloomustava maksimaalse elueelirimismahu Vxmax = Vt - Vg Vg = 0,1 · 124,4 cm3 = 12,44 cm3 Vxmax = 124,4 cm3 12,44 cm3 = 111, 96 cm3 Arvutasin fraktsioonide üldarvu n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2ml; seega n = Vxmax / 2 = 111,96 cm3 / 2 = 55, 98 56 Katseklaasistatiivi asetasin fraktsioonide arvule vastava hulga kindla mahu järgi ( 2ml ) kalibriitud katseklaase ja numereerisin need.
Vxmin on võrdne kolonni vaba mahu ehk graanulitevahelise vedeliku mahuga: Vxmin=Vv Ained, mis täielikult difundeeruvad geeli pooridesse (väiksema molekulmassiga), liiguvad kolonnis kõige aeglasemalt ja väljuvad maksimaalse elueerimismahuga Vxmax, mis on lähedane suurus kolonni kogumahule Vt. Protsessi saab lõppenuks lugeda, kui Vxmax=Vt (kolonnist väljuva eluaadi maht on ligikaudu võrdne kolonni kogumahuga). Kui on teada geelimaatriksi maht Vg, siis saab maksimaalse elueerimismahu Vxmax arvutada nii: Vxmax=Vt-Vg. Neid aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda kasutatava geeli pooridesse ja mille elueerimismaht Vx on vaadeldavad kolonnis kindlaks määratud, iseloomustatakse liikuvusteguriga Rf. Valem on selline: Rf=Vx-Vxmin/Vxmax-Vxmin, kusjuures Rf väärtused peavad jääma vahemikku 0...1. Kromatogramm on eluaadi fraktsioonides sisalduva aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vahelise sõltuvuse graafik
on võrdne kolonni vaba mahu ehk graanulitevahelise vedeliku mahuga. Vx min = Vv Aine, mis jõuab kolonnist viimasena, väljub maksimaalse elueerimismahuga(Vxmax). Selle aine molekulid on küllaltki väiksed, et täielikult difundeeruda geeli pooridess ning liiguvad aeglasem, kui teiste ainete molekulid. See maht on peaaegu võrdne kasutava kolonni kogumahuga(Vt). Vx max Vt Kui geelimaatriksi maht Vg on teada, siis vib maksimaalse elueerimismahu Vxmax ka arvutada. Vxmax = Vt Vg Seega kasutatava geelkromatograafia kolonni iseloomustamiseks on vaja teada kahte olulist parameetrit: · kolonni vaba mahtu Vv (Vx min), s.o eluaadi mahtu, millega väljuvad molekulid, mis antud geeli pooridesse ei mahu, · maksimaalset elueerimismahtu Vxmax, s.o eluaadi mahtu, millega väljuvad
muuda katse tulemusi. Läbi tulnud vedelik kogutakse 2ml fraktsioonidena katseklaasidesse, et neid saaks spektromeetriliselt analüüsida. Vastavalt fraktsiooni värvile mõõdetakse tema optiline tihedus kindlal lainepikkusel. Optiline tihedus määrab aine kontsentratsiooni. Geelkromatograafia kolonni iseloomustavad järgmised mahud: Vt täidise maht Vv kolonni vaba maht (graanulitevahelise vedeliku maht) Vs graanulitesisese vedeliku maht Vg geelimaatriksi maht Vt=Vv+Vs+Vg Ainet iseloomustab elueerimismaht ehk väljumismaht Vx. See on eluaadi maht, mis on kogutud kuni aine maksimaalse kontsentratsiooniga fraktsiooni kolonnist väljumiseni. Kui mingid segus olevad molekulid on liiga suured mahtumaks geeli pooridesse, siis väljuvad nad kolonnist esimesena, st neil on minimaalne elueerimismaht Vxmin, mis võrdub kolonni vaba mahuga. Vxmin = Vv
- võrdne graanulitevahelise vedeliku mahuga Vxmin = Vv MAKSIMAALNE ELUEERIMISMAHT (Vxmax): - Ained, mille molekulmass on väiksem, difundeeruvad täielikult geeli pooridesse ning liiguvad kolonnis kõige aeglasemalt - on arvväärtuselt lähedane kasutatava kolonni kogumahule Vt. Kromatografeerimise protsess on lõpetatud, kui kolonnist väljunud vedeliku (eluaadi) üldmaht võrdub ligikaudu kolonni kogumahuga. Kui geelimaatriksi maht Vg on teada, siis võib maksimaalse elueerimismahu ka arvutada Kasutatava geelkromatograafia kolonni iseloomustamiseks on vaja kaht parameetrit: · kolonni vaba mahtu Vv ), s.o eluaadi mahtu, millega väljuvad molekulid, mis antud geeli pooridesse ei mahu · maksimaalset elueerimismahtu , s.o eluaadi mahtu, millega väljuvad need molekulid, mis antud geeli graanulitesse täielikult sisenevad LIIKUVUSTEGUR (Rf): ---> Rf arvväärtused jäävad vahemikku 0..
muuda katse tulemusi. Läbi tulnud vedelik kogutakse 2ml fraktsioonidena katseklaasidesse, et neid saaks spektromeetriliselt analüüsida. Vastavalt fraktsiooni värvile mõõdetakse tema optiline tihedus kindlal lainepikkusel. Optiline tihedus määrab aine kontsentratsiooni. Geelkromatograafia kolonni iseloomustavad järgmised mahud: Vt täidise maht Vv kolonni vaba maht (graanulitevahelise vedeliku maht) Vs graanulitesisese vedeliku maht Vg geelimaatriksi maht Vt=Vv+Vs+Vg Ainet iseloomustab elueerimismaht ehk väljumismaht V x. See on eluaadi maht, mis on kogutud kuni aine maksimaalse kontsentratsiooniga fraktsiooni kolonnist väljumiseni. Kui mingid segus olevad molekulid on liiga suured mahtumaks geeli pooridesse, siis väljuvad nad kolonnist esimesena, st neil on minimaalne elueerimismaht V xmin, mis võrdub kolonni vaba mahuga. Vxmin = Vv Ained, mille molekulid on piisavalt väiksed, et mahtuda täielikult geeli pooridesse
väljavooluni. Kogusin fraktsiooni mõõtekolbi. 5. Edasi kogusin fraktsiooni katseklaasidesse, mis olid kalibreeritud 2ml peale. Nii tegin kuni kolonnis polnud enam lahutatavaid aineid. 6. Kui sininse, pruuni ja kollase värvusega fraktsioonid olid kogutud, mõõtsin ära nende optilised tihedused kindlal lainepikkusel spektrofotomeetriga. Arvutused: Geelisamba kõrgus: 31cm Diameeter: 2cm, raadius=1cm, seega kolonni maht: 3,14x31=97,34 k=0,1 geelimaatriksi maht Vg= 0,1x97,34= 9,734 ml Maksimaalne elueerimismaht: Vxmax= Vt-Vg: 97,34-9,734= 87,6ml Fraktsioonide üldarv n= 2ml n= Vxmax/2 =87,6/2= 43,8 Kokku tuli 50 fraktsiooni, igaühes 2ml proovi, mõõtekolvis oleva vedeliku maht: 29 ml, seega teeb kokku 50x2= 100+29=129 ml Vx= 29ml Rf=29-97,34/87,6-97,34=7,016 Proovide optilised tihedused: Lainepikkus 670 nm (sinine) 1- 0 2- 0 3- 0,066 4- 0,142 5- 0,191 6- 0,188 7- 0,134 8- 0,077 (pruunid) Lainepikkus 410 nm 9- 0,689 10- 0,806
Vxmax = Vt - Vg Neid aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda kasutatava geeli pooridesse ja mille elueerimismaht Vx on kindlaks määratus, iseloomustatakse liikuvusteguriga Rf. Rf = Vx Vxmin / Vxmax - Vxmin Töö käik · Kontrollitakse kolonni vertikaalsust · kolonni täidis: Sephadex G-75, tegur k = 0,1 · geelisamba kõrgus l = 31,4 cm · diameeter d = 1,6 cm · täidise kogumaht Vt = 63 ml · geelimaatriksi maht Vg = 0,1 63 = 6,3 ml · maksimaalne elueerimismaht Vxmax = 63 6,3 = 56,7 ml · fraktsioonide üldarv n = 56,7 / 2 = 29 · statiivi võetakse vastav arv katseklaase · eluendi koostis: 50nM Tris-HCl, 150mM NaCl, pH = 7,5 · uuritav segu: o dekstraansinine (6mg/ml) o müoglobiin (6mg/ml) o 2,4-dinitrofenüülaspartaat (0,6mg/ml) · kolonni täidise pinnal olev eluent lastakse välja
See on selline elulaadi maht, mille juures kolonnist väljub fraktsioon, milles vastava aine kontsentratsioon on maksimaalne. Töö käik Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine Esmalt märkisime üles Sephadex’i margi=> 675 ja seda iseloomustava teguri k=>0,1. Seejärel mõõdetakse geelisamba kõrgus L=>12,5 cm ja ja diameeter d=>2,7 cm. Arvutatakse täidise kogumaht Vt=>71,53 Arvutatakse geelimaatriksi maht Vg = k • Vt=>7,15 ja sellest lähtuvalt kolonni iseloomustav maksimaalne elueerimismaht Vx max = Vt – Vg=>64.38. Arvutatakse fraktsioonide üldarv n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml; seega n = Vx max / 2=>32,19. Katseklaasistatiivi asetatakse fraktsioonide arvule vastav hulk kindla mahu järgi (2ml) kaliibritud katseklaase ja nummerdatakse. Seejärel pandi kirja eluent=> NaCl 0,15 M.
on võrdne kolonni vaba mahu ehk graanulitevahelise vedeliku mahuga. Vx min = Vv Aine, mis jõuab kolonnist viimasena, väljub maksimaalse elueerimismahuga(Vxmax). Selle aine molekulid on küllaltki väiksed, et täielikult difundeeruda geeli pooridess ning liiguvad aeglasem, kui teiste ainete molekulid. See maht on peaaegu võrdne kasutava kolonni kogumahuga(Vt). Vx max Vt Kui geelimaatriksi maht Vg on teada, siis vib maksimaalse elueerimismahu Vxmax ka arvutada. Vxmax = Vt Vg Seega kasutatava geelkromatograafia kolonni iseloomustamiseks on vaja teada kahte olulist parameetrit: · kolonni vaba mahtu Vv (Vx min), s.o eluaadi mahtu, millega väljuvad molekulid, mis antud geeli pooridesse ei mahu, · maksimaalset elueerimismahtu Vxmax, s.o eluaadi mahtu, millega väljuvad
5. Edasi kogusin fraktsiooni katseklaasidesse, mis olid kalibreeritud 2ml peale. Nii tegin kuni kolonnis polnud enam lahutatavaid aineid. 6. Kui sininse, pruuni ja kollase värvusega fraktsioonid olid kogutud, mõõtsin ära nende optilised tihedused kindlal lainepikkusel spektrofotomeetriga. Arvutused: Geelisamba kõrgus: 17,8cm Diameeter: 2,4cm, raadius=1,2cm, seega kolonni maht: Vt=3,14x1,22x17,8=80,53 ml pundumistegur k=0,1 geelimaatriksi maht Vg= 0,1x80,53=8,053 ml Maksimaalne elueerimismaht: Vxmax= Vt-Vg=80,53-8,053=72,477 ml Fraktsioonide(2ml) üldarv n= Vxmax/2 =72,477/2=36,24 ~36 Kokku võtsin 34 fraktsiooni, igaühes 2ml proovi, mõõtekolvis oleva eeljooksu maht: 24 ml, seega teeb kokku 34x2= 68+24=92 ml Fraktsiooni number Lainepikkus Elueerimismaht V, ml Optiline tihedus, A Ühendatud fraktsioon 670 24 0
elueerimismaht Vx vaadeldavas keskkonnason kindlaks määratud, iseloomustatakse liikuvusteguriga Rf: Rf = Vx - Vxmin / Vxmax - Vxmin Töö käik: Kolonn ja selle ettevalmistamine: · Kontrollisin kolonni vertikaalsust ja märkisin üles täidise margi: Sephadex G-75 k=0,1. · Mõõtsin geelisamba (täidis) kõrguse L = 32,2 cm ja diameetri d 1,9 cm, kasutades joonlauda. Arvutasin täidise kogumahu Vt = 91,296. · Arvutasin geelimaatriksi mahu Vg = k * Vt = 9,1296 ja kolonnile iseloomuliku max elueerimismahu Vxmax = Vt Vg = 82, 16665. · Arvutasin fraktsioonide üldarvu n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml ehk n = Vxmax / 2 = 41,08. · Nummerdasin vajaliku arvu kaliibritud katseklaase, märkisin üles voolutuslahuse koostise: elueerimispuhver NaCl M =0,15 pH = 7,5, panin valmis 50 ml seisukolvi täidise pinnal oleva eluendi kogumiseks. Segu komponentide lahutamine:
eluaadi fraktsioonides sisuldava aine kontsentratsioon ja eluaadi mahu vahe. Töö käik Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine Kolonn nr.1.Kontrollisin kolonni vertikaalsust ja märkisin üles täidise margi: Sephadex G-75. Pundumistegur k=0,1. Joonlauda abiga mõõtsin geelisamba (täidis) kõrguse L = 17,4 cm ja diameetri D = 2,8 cm. Arvutasin täidise kogumahu Vt = = 76,49 cm3 Arvutasin geelimaatriksi mahu Vg = k Vt = 7,65 cm ja kolonni iseloomustav maksimaalne elueerimismahu Vxmax = Vt Vg = 68,84 cm. Arvutasin fraktsioonide üldarvu n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml ehk n = Vxmax / 2 = 34,42. Nummerdasin kaliibritud katseklaase (35t) Märkisin üles voolutuslahuse koostise: elueerimispuhver NaCl M =0,15 pH = 7,5, Panin valmis 50 ml seisukolvi täidise pinnal oleva eluendi kogumiseks. Segu komponentide lahutamine
viimane värviline komponent ja eluaat muutus värvituks. Fraktsioone analüüsisin spektrofotomeetri abil. Igal ainel oli oma neeldumismaksimum. Täiesti värvusetute fraktsioonide optilise tiheduse väärtused võrdusid 0-ga ja neid polnud vaja mõõta. Tulemused: · Kolonni täidiseks on Sephadex'i G-75, iseloomustav pundumistegur k on 0,1 · Geelisamba kõrgus L=33 cm ja diameeter d=1,6 cm · Täidise kogumaht Vt=L** =33* * =66,35 ml · Geelimaatriksi maht Vg = k · Vt=0,1*66,35=6,635 ml maksimaalne elueerimismaht Vxmax = Vt Vg= 66,35-6,635=59,715 ml · Fraktsioonide üldarv n, ühe fraktsiooni mahuks 2 ml; seega n = Vxmax/2=59,715/2=30 · Elueerimislahus 20 mM Tris/HCl 0,15 M NaCl pH 7,4 Optiline Elueerumismaht Fraktsiooni nr tihedus, A V, ml ühendatud fraktsioon 0 20
Kolonni iseloomustramine ja ettevalmistamine: · Kontrollin kolonni vertikalsust. On vertikaalne. · Märgin üles kasutatava kolonni täidiseks oleva Sephadex'i mark ja seda iseloomustav tegur k , mille väärtus sõltub kasutatava geeli pundumisastmest. Sephadex G-75, pundumistegur k= 0,1. · Mõõden geelisamba (täidise) kõrgus L ja diameeter d, kasutades sobiva joonlauda. L=32,5 cm. d=1,9 cm. · Arvutan täidise kogumaht Vt . · Arvutan geelimaatriksi maht Vg . · Arvutan kolonni iseloomustav maksimaalne elueerimismaht Vxmax. · Arvutan fraktsioonide üldarv n, arvestades, et ühe fraktsiooni mahuks on 2 ml. n= Vxmax/2 =82,89/2=41,445=~42 · Katseklaasistatiivi asetan fraktsioonide arvule vastav hulk kindla mahu järgi (2ml) kaliibritud katseklaase ja nummerdan. · Voolutuslahus:Dekstraansinine,Müoglobiin,DNP-Aspartaat.Kasutasin automaatpipetti mahuga 0,5 ml. · Kolonni pinnal olev eluent kogun seisukolbi.
Töö käik Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine Tööd teostasin kolonni juures nr 2. Kontrollisin kolonni vertikaalsust ja märkisin üles täidise margi: Sephadex G-75. Pundumistegur k=0,1. Mõõtsin geelisamba (täidis) kõrguse L = 23,3 cm ja diameetri D = 1,6 cm. Arvutasin 2 täidise kogumahu Vt = π ∙ r ∙ L = 0,82*23,3* π =46,85 cm3 Arvutasin geelimaatriksi mahu Vg = k ∙ Vt = 0,1*46,85= 4,685 cm ja kolonni iseloomustav maksimaalne elueerimismahu Vxmax = Vt – Vg = 42,162 cm. Arvutasin fraktsioonide üldarvu n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml ehk n = Vxmax / 2 = 42,165/2≈21. Võtsin 21 kaliibritud katseklaasi Märkisin üles voolutuslahuse koostise: elueerimispuhver NaCl M =0,15 pH = 7,5, Panin valmis 50 ml seisukolvi täidise pinnal oleva eluendi kogumiseks.
Nad väljuvad
minimaalse elueerimismahuga Vxmin, mis on võrdne kolonni graanulitevahelise vedeliku mahuga: Vxmin=Vv.
Kõige aeglasemalt ja maksimaalse elueerimismahuga Vxmax, väljuvad molekulid, mis on küllalt väikesed, et
täielikult difundeeruda geeli pooridesse.
Kromatografeerimise võib lugeda lõpetatuks, kui kolonni läbinud vedeliku üldmaht ületab kolonni
kogumahu: Vxmax Vt.
Vxmax saab ka arvutada, teades geelimaatriksi mahtu: Vxmax=Vt Vg
Neid aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda kasutatava geeli pooridesse ja mille elueerimismaht
Vx on kindlaks määratud, iseloomustatakse liikumisteguriga f: , (0
Nad
väljuvad minimaalse elueerimismahuga Vxmin, mis on võrdne kolonni graanulitevahelise
vedeliku mahuga:
Vxmin=Vv.
Kõige aeglasemalt ja maksimaalse elueerimismahuga Vxmax, väljuvad molekulid, mis on
küllalt väikesed, et täielikult difundeeruda geeli pooridesse.
Kromatografeerimise võib lugeda lõpetatuks, kui kolonni läbinud vedeliku üldmaht ületab
kolonni kogumahu:
Vxmax>Vt.
Vxmax saab ka arvutada, teades geelimaatriksi mahtu:
Vxmax=Vt Vg
Neid aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda kasutatava geeli pooridesse ja mille
elueerimismaht Vx on kindlaks määratud, iseloomustatakse liikuvusteguriga Rf: ,kus (0
elueerimismaht Vx vaadeldavas keskkonnason kindlaks määratud, iseloomustatakse liikuvusteguriga Rf: Rf = Vx - Vxmin / Vxmax - Vxmin Töö käik Kolonn ja selle ettevalmistamine: · Kontrollisin kolonni vertikaalsust ja märkisin üles täidise margi: Sephadex fine G-75 k=0,1. · Mõõtsin geelisamba (täidis) kõrguse L = 16,8 cm ja diameetri d = 2,7 cm r= 1,35cm, kasutades joonlauda. Arvutasin täidise kogumahu Vt = L·r2 = 114,45 · Arvutasin geelimaatriksi mahu Vg = k * Vt = 11,44 ja kolonnile iseloomuliku max elueerimismahu Vxmax = Vt Vg = 103,01 · Arvutasin fraktsioonide üldarvu n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml ehk n = Vxmax / 2 = 53 · Nummerdasin vajaliku arvu kaliibritud katseklaase, märkisin üles voolutuslahuse koostise: elueerimispuhver NaCl M =0,15 pH = 7,5, panin valmis 50 ml seisukolvi täidise pinnal oleva eluendi kogumiseks. Segu komponentide lahutamine: · Segu nr
elueerimismahuga , mis on võrdne kolonni vaba mahu ehk graanulitevahelise vedeliku mahuga. Ained, mille molekulmass on küllalt väike, et täielikult difundeerida geeli pooridesse, liiguvad kolonnis kõige aeglasemalt ja väljuvad maksimaalse elueerimismahuga , mis on arvväärtuselt lähedane kasutatava kolonni kogumahule . Kromatografeerimise protsessi võib lugeda lõpetatuks, kui kolonnist väljunud eluaadi üldmaht võrdub ligikaudu kolonni kogumahuga. Kui geelimaatriksi maht on teada, siis võib maksimaalse elueerimismahu välja arvutada. Geelkromatograafia kolonni iseloomustamiseks on vaja teada kolonni vaba mahtu (eluaadi maht, millega väljuvad molekulid, mis antud geeli pooridesse ei mahu) ja maksimaalset elueerimismahtu (eluaadi maht, millega väljuvad need molekulid, mis antud geeli graanulitesse täielikult sisenevad). Neid aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda
Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine ·Kontrollisin kolonni vertikaalsust, asendit korrigeerida polnud vajalik. ·Kolonnis oleva Sephandex'i mark: Sephandex G75 fraktsioonimispiirkond 3000-80000 D, k=0.1 (väärtus sõltub kasutatava geeli pundumisastmest) ·Mõõtsin geelisamba kõrguse L ja diameetri,kasutades sobivat joonlauda.n L=28cm; d=2.2cm. ·Arvutasin täidise kogumahu Vt= r 2 *L= *1.1²*28=106 cm³ ·Arvutasin geelimaatriksi mahu Vg=k*Vt=0.1*106=10.6 ja sellest lähtuv kolonni iseloomustav maksimaalne elueerimistmaht Vx;max=Vt-Vg=106-10.6=95.4 ·Arvutasin fraktsioonide üldarvu, arvestan kindlaks mahuks 2ml. n=Vx;max/2=95.4/2=47.7. (Kuigi selline arvutus, läks mul vaja 36 katseklaasi). ·Asetasin katseklaasistatiivi fraktsiooni arvule vastava hulga kindla mahu järgi (2ml) kaliibritud katseklaase ja nummerdan. ·Paigutasin kolonni lähedusse voolutuslahuse (eluendi) pudeli ja märkisin üles selle koostise.
Ained, mille molekulmass on küllalt väike, et täielikult difundeeruda geeli pooridesse, liiguvad kolonnis kõige aeglasemalt ja väljuvad maksimaalse elueerimismahuga Vxmax, milline on arvväärtuselt lähedane kasutatava kolonni kogumahule Vt. 48 Seega võib kromatografeerimise protsessi lugeda lõpetatuks, kui kolonnist väljunud vedeliku (eluaadi) üldmaht võrdub ligikaudu kolonni kogumahuga. Vxmax Vt Kui geelimaatriksi maht Vg on teada, siis vib maksimaalse elueerimismahu Vxmax ka arvutada. Vx max = Vt Vg Seega kasutatava geelkromatograafia kolonni iseloomustamiseks on vaja teada kahte olulist parameetrit: ¾ kolonni vaba mahtu Vv (= Vxmin), s.o eluaadi mahtu, millega väljuvad molekulid, mis antud geeli pooridesse ei mahu, ¾ maksimaalset elueerimismahtu Vxmax, s.o eluaadi mahtu, millega väljuvad
annaabi.ee 
