Geneetiline muutlikkus molekulaarsel tasemel. Looduslikes populatsioonides esinev fenotüübiline muutlikkus ei kajasta alati populatsioonides esinevat geneetilist muutlikkust. Selleks, et määrata geneetilise muutlikkuse osa kogu muutlikkuses, analüüsitakse juhuslikult valitud geenide alleelset varieeruvust. Mutatsioonid konkreetses geenis ning sellest tulenevad muudatused polüpeptiidi aminohappelises järjestuses on tuvastatavad mutantsete polüpeptiidide erineva liikuvuse kaudu geelelektroforeesil. Uuritavate polüpeptiidide asukoht geelis tuvastatakse kas nendele polüpeptiididele iseloomulike ensüümreaktsioonide teel (juhul, kui reaktsiooni tulemusena tekib geelis eristatav värviline produkt) või uuritavate polüpeptiidide vastaste antikehade abil. Ka inimese ensüümide puhul on kirjeldatud ulatuslik polümorfism. Näiteks 24-st oksüdoreduktaaside lookusest on 7 polümorfsed, transferaaside 29-st lookusest aga 10 (vt. Tabel 28.2).
- Denaturatsioon 14. Kuidas nimetatakse PCR analüüsil praimerite seondumise etappi?- annealing 15. Millist kliinilist materjali saab kasutada PCR meetodil haigustekitaja tuvastamiseks?- röga, lima, seemnevedelik (DNA) 16. Millised on etapid haigustekitaja tuvastamiseks kliinilisest materjalist PCR meetodil?-algmaterjalisd DNA eraldamine ja puhastamine; PCR reaktsioon; restriktsioon; tulemuste visualiseerimine geelelektroforeesil 17. Nimeta PCR jaoks vajalikud komponendid?- DNA->praimerid->nukleotiidid->ensüüm Taq-> puhver ja MgCl 18. Mis on praimer ja milleks seda vaja on?- 15-30 nukleotiidi pikk üheahelaline DNA lõik; vajalik komplementaarsuse tõttu saavad seonduda uuritava DNA molekulile ja selle tähistada 19. Mille poolest erineb multiplex PCR tavalisest PCR-ist?-sama PCR ajal kasutatakse mitut praimerite paari, mitme erineva mikroobi tuvastamiseks samast DNA proovist 20
Praimer. Tuubis segatakse kokku: nukleotiidid (kõiki nelja erinevat), DNA-polümeraas, oma DNA lahus, praimerid - lühikesed DNA lõigud, mis on komplementaarsed analüüsitava DNA-piirkonna mõlema “otsaga”. Tuub pannakse 3 tunniks PCR-masinasse. PCR-masinas toimub DNA uuritavate lõikude paljundamine tänu pidevale temperatuuride vaheldumisele Tulemus: uuritavaid DNA-lõike on paljundatud vähemalt 30 miljonile. Nii suurt kogust saab näha geelelektroforeesil. PCR-masinast võetud DNA-proovid pannakse geeli auku. • Geel asetatakse elektroforeesivanni, • DNA-lõigud liiguvad + pooluse poole seda kiiremini, mida väiksemad nad on. Umbes tunni aja pärast näeme UV-kiirgusel lahutatud DNA-lõikude “bände” 14. Isiku molekulaarbioloogiline tuvastamine. DNA sõrmejälgede metoodika. Polümorfsed markerid; Tandem(kordus)järjestused, STR – lühikesed kordusjärjestused. SNP - ühenukleotiidne erisus/varieeruvus
Praimerid ühinevad DNA-polümeraas replikeerib, alustades 3`otsast Need 2 fragmenti on esimesed tulemused. Tsüklit korratakse 34X, saadakse 30 miljonit Tulemus: uuritavaid DNA-lõike on paljundatud vähemalt 30 miljonile. Nii suurt kogust saab näha geelelektroforeesil. PCR-masinast võetud DNA-proovid pannakse geeli auku. · Geel asetatakse elektroforeesivanni, · DNA-lõigud liiguvad + pooluse poole seda kiiremini, mida väiksemad nad on. Umbes tunni aja pärast näeme UV- kiirgusel lahutatud DNA-lõikude "bände " Saame üksteise sarnasusi või erinevusi näha ja võrrelda. Tänan tähelepanu eest!
Spetsiifiline aktiivsus – ensüüm katalüüsib talle spetsiifilist reaktsiooni ja spetsiifiliste molekulidega?. Nt. eksonukleaasne aktiivsus, peptidaasne aktiivsus? Geelfiltratsioon Ioonvahetuskromatograafia Afiinsuskromatograafia SDS geelelektroforees – geelelektroforees naatrium dodetsüül sulfaadiga (Sodium Dodecyl Sulfate); SDS annab valkudele tugeva negatiivse laengu, mistõttu on elektroforeesil võimalik eristada valke vaid nende massi järgi. Tavalisel geelelektroforeesil eristuvad valgu massi ja laengu järgi – mida väiksem mass ja suurem laeng, seda kiiremini liiguvad geelis. Isoelektriline fokuseerimine – elektroforeesi geeli on moodustatud pH gradient; sellel geelil liiguvad valgud seni, kuni on jõudnud sellise pH-ga geeli ossa, mis vastab nende isoelektrilisele puntkile (pI) e. kui valgu summaarne laeng muutub nulliks ja kui laeng on null ei ole võimalik enam elektriväljas edasi liikuda.
coli tuvastamisel indooltest annab positiivse vastuse, kuid GUR aktiivsus puudub? gusA geen on defektne. 16. Miks peab PCR-il kasutama kahte praimerit? DNA-l on kaks ahelat. 17. Miks peab PCR-il kasutama termostabiilset DNA polümeraasi? DNA denatureeritakse 94-98 kraadi juures. Tavaline polümeraas denatureerub. 18. Miks valmistatakse elektroforeesi puhul geel puhvris, mitte tavalises vees? pH stabiilsuse tagamiseks, PCR toimub ainult kindlal pH-l. 19. Kuidas eristada DNA-fragmente geelelektroforeesil? Molekulid tuleb geelis nähtavaks tuua. Agaroosi kasutatakse maatriksina. 20. Miks voolutatakse geelelektroforeesil paralleelselt reeglina ka suurusmarkerit? Suurusmarker koosneb kindlaksmääratud suurusega molekulide segust, saab määrata meie proovi molekuli suurust. 21. Millise vea oled teinud, kui elektroforeesi ajal proovide liikumist tähistav marker liigub vales suunas? Klemmid valet pidi. 7. teema 1. Mida mõistetakse bakterite kasvu all?
esineb mitu vormi, mis kõik erinevad üksteisest ensümaatilise aktiivsuse poolest. Sama geeni erinevate alleelide poolt kodeeritud ensüüme nimetatakse allosüümideks. Inimese vererakkudes on kirjeldatud kolme põhilist aluselise fosfataasi ACP varianti, mida määravad kolm alleeli ACPA, ACPB ja ACPC. Nende kolme alleeli kombineerumise tulemusena võivad tekkida kuus erinevat genotüüpi. Aluselise fosfataasi A, B ja C vormid on funktsionaalselt sarnased, kuid erinevad oma liikuvuselt geelelektroforeesil, sest nende aminohappelises järjestuses on erinevusi. Kuue erineva genotüübi puhul on valkude elektroforeetiline pilt erinev. Kõigi kolme homosügootse variandi puhul on geelis elektroforeetiliselt tuvastatavad kaks erinevat, igale tüübile spetsiifilist valgubändi, sest samal polüpeptiidil on kaks konformatsiooni, mis liiguvad geelis erinevalt. Iga erineva genotüübi puhul on ACP aktiivsus erinev, püsides teatavas väärtuste vahemikus. Erinevate genotüüpide korral need väärtused
Punktis 7 pestakse lahust 70% etanooliga. 3.2) Kui palju tuleb võtta RNaasA-d, mille algkontsentratsioon on 10 mg/ml, et selle lõppkontsentratsioon oleks 5 ng/l 1 ml-s TE-s? Mitu korda tuleb RNaasi lahjendada? On vaja võtta 1ml RnaasA-d, 2000x. 3.3) Millise laenguga on DNA? Kas geeli ,,hammastega" ots (millesse on kantud DNA) tuleb asetada foreesivanni + või elektroodi poole. DNA on negatiivse laenguga, tuleb asetada eletroodi poole. 3.4) Milleks kasutatakse geelelektroforeesil etiidiumbromiidi (EtBr)? Kuidas EtBr toimib? DNA nähtavaks tegemiseks (EtBr interakteerub lämmastikaluste vahele ning hiljem UV-valguses fluorestseerub), vähendab DNA laengut (DNA muutub pikemaks ja jäigemaks). 3.5) Mitu grammi agaroosi on vaja 40 ml 1,5 % geeli tegemiseks? 80 ml 0,8 % geeli tegemiseks? Et valmistada 40 ml 1.5% geeli on vaja 0,6 g agaroosi ja , et valmistada 80 ml 0,8% geeli on vaja 0,64 g agaroosi.
lõppkontsentratsioon oleks 5 ng/l 1 ml-s TE-s? Mitu korda tuleb RNaasi lahjendada? On vaja võtta 1ml RNaasA-d, et selle lõppkontsentratsioon oleks 5ng/µl 1 ml- s TE- s. Tuleb lahjendada RNaasi 2000 korda. 3.3) Millise laenguga on DNA? Kas geeli ,,hammastega" ots (millesse on kantud DNA) tuleb asetada foreesivanni + või elektroodi poole. DNA on negatiivse laenguga. Geeli ,,hammastega" ots (millesse on kantud DNA) tuleb asetada foreesivanni elektroodi poole. 3.4) Milleks kasutatakse geelelektroforeesil etiidiumbromiidi (EtBr)? Kuidas EtBr toimib? EtBr on vajalik elektroforeesil, et visualiseerida meie tulemused ehk selleks, et elektroforeesi pildil oleks võimalik eristada meie inserdi erinevaid osasid. Veel EtBr aitab otsustada millal on õige aeg fooresi lõpetada. Pärast kui DNA molekul on lahti keerdunud interakteerub EtBr lämmastikaluste vahel ja pärast fluorestseerib UV-kiirgusel. 3.5) Mitu grammi agaroosi on vaja 40 ml 1,5 % geeli tegemiseks? 80 ml 0,8 % geeli tegemiseks?
Hemolüüsitest - kasutatakse seroloogilisi plaate veregruppide määramiseks. Kui täpp on augu põhjas – hemolüüsi ei toimunud ja antigeen puudub. Kui täppi pole, on toimunud hemolüüs (antigeen olemas). Veised, hobused. Verest erütrotsüüdid kätte. Kasutatakse lisaks komplementi. Aglutinatsioonitest - määratakse veregruppe. Segatakse kokku veri ja antikehadega reagent. Kui tilgas kleepuvad verelibled kokku, siis esineb teatud antigeen selle antikeha vastu. Valgutüübid – geelelektroforeesil - valguosakesi lahutatakse elektriväljas – mitu fraktsiooni tekkis ja kui kaugele jooksis. + Ülesanded loomade põlvnemisandmete õigsuse kontrollimise kohta
lahutatud komponenti(te) edasiseks kasutamiseks. Seega on tegu kromatograafilise puhastamisega. Analüütilise kromatograafia korral kasutatakse oluliselt väiksemaid ainete koguseid (enamasti mikrogrammides) ja eesmärk on määrata komponentide suhteline sisaldus segus. 49. Elektroforees. Geelelektroforees on tänapäeval võimas rutiinne meetod erineva suuruse ja laenguga makromolekulide eraldamiseks. DNA molekulid on negatiivselt laetud ja liiguvad geelelektroforeesil elektroodilt + elektroodile. Kuivõrd DNA molekulidel on massist otsesõltuv laeng, siis sõltub nukleiinhapete liikuvus agaroos- ja polüamiidgeelis eelkõige nende suurusest. Need gelid on molekulaarseks sõelaks, kus suuremad fragmendid liiguvad aeglasemalt ja väiksemad kiiremini. Agaroosgeele on parem kasutada suuremate DNA fragmentide eraldamiseks,
Kui täpp on augu põhjas – hemolüüsi ei toimunud ja antigeen puudub. Kui täppi pole, on toimunud hemolüüs (antigeen olemas). Veised, hobused. Verest erütrotsüüdid kätte. Kasutatakse lisaks komplementi. Aglutinatsioonitest - määratakse veregruppe. Segatakse kokku veri ja antikehadega reagent. Kui tilgas kleepuvad verelibled kokku, siis esineb teatud antigeen selle antikeha vastu. Valgutüübid – geelelektroforeesil - valguosakesi lahutatakse elektriväljas – mitu fraktsiooni tekkis ja kui kaugele jooksis.
allpool) abil. Sel moel on võimalik teha indiviiditi kindlaks, kas vaadeldud piirkonnas esineb indiviidide vahel erinevusi. Mõnel juhul on neil väikestel erinevustel väga suur mõju konkreetse indiviidi fenotüübile. Näiteks on võimalik tuvastada inimese vastuvõtlikkust HIV-ile (ühele tüvele), kuidas inimene tunneb viiendat põhimaitset – umamit, sugulusastet jne. 138. DNA - geelelektroforeesi põhimõtted Geelelektroforeesil pannakse DNA fragmendid liikuma elektriväljas poorses geelis. DNA proovid sisestatakse geeli ühte serva ja geel asetatakse elektrit juhtiva vedeliku sisse (sama puhverlahus, millega algselt geel valmistati). Selliselt valmistatud süsteemis on nii geel kui seda ümbritsev lahus sarnase elektrijuhtivusega (mõlemates on samad lahustunud soolade ioonid sisuliselt samas kontsentratsioonis). Kui nüüd sellisest süsteemist juhtida läbi
mutatsioone sisaldava DNA lõikamisel mingi kindla restriktaasiga teistsuguse pikkusega fragmente. Nii võib erinevatest isolaatidest pärinev DNA olla DNA restriktsioonanalüüsi põhjal restriktsioonisaitide suhtes polümorfne erinevate isolaatide puhul tekivad erineva pikkusega restriktsioonifragmendid. Restriktsioonifragmentide pikkuse polümorfismi RFLP-d on võimalik detekteerida näiteks "Southern blot" analüüsil. DNA restrikteeritakse, fragmendid lahutatakse geelelektroforeesil, kantakse filtrile ja hübridiseeritakse spetsiifilise radioaktiivse DNA prooviga. RFLP-d kasutatakse geneetilise markerina kromosoomide kaardistamisel. Samuti võimaldab RFLP analüüs hinnata, kas ristamisel saadud järglased on vanemtüüpi või rekombinantsed. juhul, kui on tegemist rekombinantidega, saab rekombinatsioonisageduse põhjal arvutada RFLP-de geneetilist distantsi. Sellist analüüsi on rakendatud näiteks taime Arabidopsis geneetilistes katsetes.
terminaalset osa kodeeriv DNA järjestus ja mõõdetakse liitvalgu ekspressiooni. Arvestama peab võimalusega, et sellise liitjärjestuse puhul võib olla muutunud mRNA stabiilsus ning see võib samuti mõjutada liitvalgu ekspressioonitaset. 5. 2-D geelid ja mass-spektromeetria. Erinevate valkude hulga hindamiseks bakterirakus kasutatakse totaalvalgu lahutamist 2-D polüakrüülamiid-geelelektroforeesil. Igale valgule vastab geelis kindel koht, kus valk on visualiseeritav täpina. Mida rohkem on valku, seda intensiivsem on vastav täpp. Kui eraldada totaalvalk erinevates tingimustes kasvatatud bakterirakkudest, näeme täppide mustris erinevusi. Mass-spektromeetria võimaldab määrata valgu järjestusi ka väga väikeste valgukoguste (pikomoolide ja isegi femtomoolide) korral, mida on võimalik saada valkude puhastamisel 2-D geelist
kõik erinevad üksteisest ensümaatilise aktiivsuse poolest. Sama geeni erinevate alleelide poolt kodeeritud ensüüme nimetatakse allosüümideks. Inimese vererakkudes on kirjeldatud kolme põhilist aluselise fosfataasi ACP varianti, mida määravad kolm alleeli ACPA, ACPB ja ACPC. Nende kolme alleeli kombineerumise tulemusena võivad tekkida kuus erinevat genotüüpi. Aluselise fosfataasi A, B ja C vormid on funktsionaalselt sarnased, kuid erinevad oma liikuvuselt geelelektroforeesil, sest nende aminohappelises järjestuses on erinevusi. Kuue erineva genotüübi puhul on valkude elektroforeetiline pilt erinev. Kõigi kolme homosügootse variandi puhul on geelis elektroforeetiliselt tuvastatavad kaks erinevat, igale tüübile spetsiifilist valgubändi, sest samal polüpeptiidil on kaks konformatsiooni, mis liiguvad geelis erinevalt. Iga erineva genotüübi puhul on ACP aktiivsus erinev, püsides teatavas väärtuste vahemikus. Erinevate
kõik erinevad üksteisest ensümaatilise aktiivsuse poolest. Sama geeni erinevate alleelide poolt kodeeritud ensüüme nimetatakse allosüümideks. Inimese vererakkudes on kirjeldatud kolme põhilist aluselise fosfataasi ACP varianti, mida määravad kolm alleeli ACPA, ACPB ja ACPC. Nende kolme alleeli kombineerumise tulemusena võivad tekkida kuus erinevat genotüüpi. Aluselise fosfataasi A, B ja C vormid on funktsionaalselt sarnased, kuid erinevad oma liikuvuselt geelelektroforeesil, sest nende aminohappelises järjestuses on erinevusi. Kuue erineva genotüübi puhul on valkude elektroforeetiline pilt erinev. Kõigi kolme homosügootse variandi puhul on geelis elektroforeetiliselt tuvastatavad kaks erinevat, igale tüübile spetsiifilist valgubändi, sest samal polüpeptiidil on kaks konformatsiooni, mis liiguvad geelis erinevalt. Iga erineva genotüübi puhul on ACP aktiivsus erinev, püsides teatavas väärtuste vahemikus. Erinevate
rakkudes. mRNA-d saab määrata üksikute rakkude puhul in situ hübridisatsiooniga, rakupopulatsioonides pöördtranskriptaasi polümeraasi ahelreaktsioonil (RT-PCR). RT-PCR-il isoleeritakse rakust mRNA, mille baasil sünteesitakse pöördtranskriptaasi abil DNA. Soovitud DNA-lõiku paljundatakse PCR-il, kasutades järjestus-spetsiifilisi praimereid. Reaktsiooni saadusi geelelektroforeesil lahutades saadakse spetsiifilise kujuga bändid. Amplifitseerunud DNA-järjestuse hulk vastab tema esindatusele mRNA-s: aktiivselt teatud tsütokiini tootvates T-rakkudes on hulgaliselt konkreetset mRNA-d, seega ka vastavalt suur hulk DNA-d RT-PCR-il. Tsütokiini-mRNA taseme hindamiseks algses koes võrreldakse saadud tulemust RT-PCR-il saadud kõigis rakkudes ekspresseeritud housekeeping- geenide mRNA hulgaga.
ribosoomiga seondumise ala) samas lugemisraamis uuritava geeni valgu N-terminaalset osa kodeeriv DNA järjestus ja mõõdetakse liitvalgu ekspressiooni. Arvestama peab võimalusega, et sellise liitjärjestuse puhul võib olla muutunud mRNA stabiilsus ning see võib samuti mõjutada liitvalgu ekspressioonitaset. 5. 2-D geelid ja mass-spektromeetria. Erinevate valkude hulga hindamiseks bakterirakus kasutatakse totaalvalgu lahutamist 2-D polüakrüülamiid-geelelektroforeesil. Igale valgule vastab geelis kindel koht, kus valk on visualiseeritav täpina. Mida rohkem on valku, seda intensiivsem on vastav täpp. Kui eraldada totaalvalk erinevates tingimustes kasvatatud bakterirakkudest, näeme täppide mustris erinevusi. Mass-spektromeetria võimaldab määrata valgu järjestusi ka väga väikeste valgukoguste (pikomoolide ja isegi femtomoolide) korral, mida on võimalik saada valkude puhastamisel 2-D geelist.
annaabi.ee 
