TTÜ keemiainstituut Analüütilise keemia õppetool YKA0040 Lahutusmeetodid keemias Laboratoorne töö: Kapillaarelektroforees CE Õpperühm: Teostaja: Ilona Juhanson YASM11 Õppejõud: Tiina Teostati: 30.10.15 Aid Teooria Kapillaarelektroforees on lahutusmeetod, kus uuritavad ained lahutatakse elektroforeetiliselt kapillaarkolonnis. Elektroforeetiline lahutamine saavutatakse seetõttu, et lahustunud ained liiguvad elektriväljas erineva kiirusega, sõltuvalt nende massi-laengu suhtest ning rakendatavast pingest. Suurema laenguga ja väiksema läbimõõduga osakesed liiguvad kiiremini kui suurema läbimõõdu ja/või väiksema laenguga osakesed. Aparatuur Koosneb pingeallikast, kahest taustelektrolüüdi anumast, millest ühes on anood
geeniteraapias kuni arheoloogiani välja. Et eraldada puhast ning identset DNA'd on vaja umbes 10 astmes 12 molekuli. Seejärel märgitakse üks ahelaots radioaktiivselt. Seejärel lahutatakse kaksikheeliks ja üks ahelatest eraldatakse analüüsiks. See jagatakse 4 katseklaasi, igasse nõusse valatakse spetsiifilist reagenti, mis lõhub valikuliselt DNA ahela ühe või kahe aluse juures neljast võimalikust. Peale seda lahutatakse kõik segud polüakrüülamiidgeeliga kaetud plaadil elektroforeetiliselt. Elektriväljas liiguvad lühikesed lõigud kiiremini ja pikemad aeglasemalt, olenevalt sellest, mida raskemad nad on. Kui katta plaat fotofilmiga tulevad nähtavale radioaktiivselt märgitud fraktsioonid. Teades otsi, mis ei ole radioaktiivsed ehk need, mis ei ole märkimata, annavad DNA otsitava järjestuse. Tänapäeval kasutatakse moodsamaid meetodeid. Nii ei lõhuta ära DNA ahelat, vaid temal üritatakse sünteesida komplementaarset ahelat. Seda meetodi kasutab DNA analüsaator.
lohustavad DNA-d juhuslikult. Praegu tuntakse ule 100 restriktsiooni ensuumi ning praktiliselt on voimalik mistahes geen voi mistahes DNA fragment genoomist valja loigata. Alljargnevalt on toodud naitena viie enamkasutatava restriktaasi aratundmis-jarjestused ja loikepiirkonnad. Selliseid DNA molekule, mis on eeltoodud moel moodustatud nimetataksegi rekombinant- DNA molekulideks, millest ka nimi kogu tehnoloogiale. Lisaks eeltoodule saab restriktaasi abil lohustatud DNA molekuli uurida elektroforeetiliselt. Nimelt moodustub restriktaasi toimel DNA molekulist erineva pikkusega fragmente (restriktsiooni fragmendid), millel on ka erinev molekulmass. DNA lohustub nii mitmeks fragmendiks kui mitu vastavat loikepiirkonda temas on. Elektroforeesil agaroosgeelis liiguvad need fragmendid erineva kiirusega asetudes ritta vastavalt molekulmassile. Need fragmendid varvitakse voi margistatakse radioaktiivsete isotoopidega ning maaratakse nende molekulmass. Sel teel saame DNA restriktsioonikaardi e profiili
Väga spetsiifilised. Leides antigeeni, jaguneb B-rakk kiirelt ning eritab antikehi, kadudes valdavalt koos antigeeniga, mille hävitab. Osa jääb alles nn mälurakkudeks. Antigeenid - võõrkehad, mis tungivad looma kudedesse. Immunotest Märgistatud antikehade kasutamine vastavate antigeenide olemasolu testimiseks (fluorestents-, ensüüm-, radioaktiivse markeriga märgistatud). Western blotting Antigeenide segu elektroforeetiline lahutamine enne testimist, tekkinud ribad transormeeritakse elektroforeetiliselt nitrotselluloosi membraanile kahe elektroodi vahele ja rakendatakse kindlat antikehade lahust vastavate antigeenide olemasolu määramiseks. Antikeha struktuur ja tema reaktsioon antigeeniga Antikeha e immunoglobuliin (IgG). Vere glükoproteiin, koosnedes kahest lühikesest 23 kD ja kahest pikast 50-75 kD peptiidahelast, mis on seotud omavahel disulfiidsidemetega. Eksisteerivad di- või pentameeridena (IgA või IgM). Antikeha seob antigeeni elektrilise või hüdrofoobse interaktsiooniga,
NH-d fikseeritakse nailonfiltrile ristsidumisel UV valgusega või immobiliseerimisel vaakumahjus (0,5 - 2 tundi; 80°C). Nitrotselluloosile saab siduda NH-d ainult vaakumahjus. NH-te seostumine membraanfiltrile on kovalentne, kuid mittespetsiifiline. Kuna DNA ülekannet agaroosgeelist nitrotselluloosfiltrile kirjeldas esmakordselt Edwin M. Southern (1975), siis nimetatakse meetodit tema auks Southern blot-iks. Northern blot-meetod tähistab RNA ülekannet geelist filtrile ja Western blot elektroforeetiliselt lahu-tatud valkude ülekannet filtrile. Nukleiinhapped hübridiseeruvad väga efektiivselt ligikaudu 25°C allpool sulamistem-peratuuri (Tm). Sulamistemperatuuri (Tm) juures on nad 50% denatureeritud olekus (üheahe-lalised). Tavaliselt hübridiseeritakse DNA-d vesilahuses temperatuuril 65°C, 6 x SSC puh-verlahuses (vt Lisa). Et vältida või vähendada NH-te mittespetsiifilist hübridisatsiooni ja seondumist filtriga, lisatakse
NH-d fikseeritakse nailonfiltrile ristsidumisel UV valgusega või immobiliseerimisel vaakumahjus (0,5 - 2 tundi; 80°C). Nitrotselluloosile saab siduda NH-d ainult vaakumahjus. NH-te seostumine membraanfiltrile on kovalentne, kuid mittespetsiifiline. Kuna DNA ülekannet agaroosgeelist nitrotselluloosfiltrile kirjeldas esmakordselt Edwin M. Southern (1975), siis nimetatakse meetodit tema auks Southern blot-iks. Northern blot-meetod tähistab RNA ülekannet geelist filtrile ja Western blot elektroforeetiliselt lahu-tatud valkude ülekannet filtrile. Nukleiinhapped hübridiseeruvad väga efektiivselt ligikaudu 25°C allpool sulamistem-peratuuri (Tm). Sulamistemperatuuri (Tm) juures on nad 50% denatureeritud olekus (üheahe-lalised). Tavaliselt hübridiseeritakse DNA-d vesilahuses temperatuuril 65°C, 6 x SSC puh-verlahuses (vt Lisa). Et vältida või vähendada NH-te mittespetsiifilist hübridisatsiooni ja seondumist filtriga, lisatakse hübridisatsioonilahusesse
glükoproteiinides. 2 globuliini fraktsioonis leidub habtoglobiin, mis keemiliselt kuulub proteoglükaanide hulka ja vaske sisaldavtsöruloplasmiin. - globuliinide hulka kuuluvad tähtsamad lipiide ja polüsahhariide kandvad proteiinid; peale lipoproteiinide rändab koos - fraktsiooniga veel rühm metalle siduvaid proteiine, nende hulgas vaske ja rauda trantsportiv transfertiin. - globuliinide heterogeenne fraktsioon sisaldab elektroforeetiliselt kõige aeglasemalt rändavaid proteiine, - globuliinide hulgas leidub enamik vere kaitse ja võitlusaineid. Füsioloogiline tähtsus: 1 lipiidide trantsport(fosfolipiidide), B11 siduv globuliin. 2 oksüdaasi aktiivsus, vase sidumine, plasmiini ja proteinaasi pidurdus, uriiniga mitteeritatava hemoglobiini sidumine. - raua trantsport, lipiidide (kolesterooli) trantsport. - immuunglobuiinid (antikehad bakteriaalsete antigeenide ja kehavõõra valgu vastu).
fosfataasi ACP varianti, mida määravad kolm alleeli ACPA, ACPB ja ACPC. Nende kolme alleeli kombineerumise tulemusena võivad tekkida kuus erinevat genotüüpi. Aluselise fosfataasi A, B ja C vormid on funktsionaalselt sarnased, kuid erinevad oma liikuvuselt geelelektroforeesil, sest nende aminohappelises järjestuses on erinevusi. Kuue erineva genotüübi puhul on valkude elektroforeetiline pilt erinev. Kõigi kolme homosügootse variandi puhul on geelis elektroforeetiliselt tuvastatavad kaks erinevat, igale tüübile spetsiifilist valgubändi, sest samal polüpeptiidil on kaks konformatsiooni, mis liiguvad geelis erinevalt. Iga erineva genotüübi puhul on ACP aktiivsus erinev, püsides teatavas väärtuste vahemikus. Erinevate genotüüpide korral need väärtused osaliselt kattuvad. Analüüsides ACP aktiivsust kogu populatsioonis saame pideva kõvera, mis näitabki, et selle tunnuse fenotüübiline muutlikkus populatsioonis on pidev. 8.2
(Hpa I) või siduvad otsad (ingl. k. cohesive ends). Viimased kujutavad endast lühikesi ühekordse ahela fragmente. Siduvate otsadega fragmente vôib omavahel taas liita, s.t teoreetiliselt võib mistahes geene omavahel liita. Selliseid DNA molekule, mis on eeltoodud moel moodustatud nimetataksegi rekombinant-DNA molekulideks, millest ka nimi kogu tehnoloogiale. Lisaks eeltoodule saab restriktaasi abil lõhustatud DNA molekuli uurida elektroforeetiliselt. Nimelt moodustub restriktaasi toimel DNA molekulist erineva pikkusega fragmente (restriktsiooni fragmendid), millel on ka erinev molekulmass. DNA lõhustub nii mitmeks fragmendiks kui mitu vastavat lõikepiirkonda temas on. Elektroforeesil agaroosgeelis liiguvad need fragmendid erineva kiirusega asetudes ritta vastavalt molekulmassile. Need fragmendid värvitakse või märgistatakse radioaktiivsete isotoopidega ning määratakse nende molekul- mass
seotuna glükoproteiinides. 2 globuliini fraktsioonis leidub habtoglobiin, mis keemiliselt kuulub proteoglükaanide hulka ja vaske sisaldavtsöruloplasmiin. - globuliinide hulka kuuluvad tähtsamad lipiide ja polüsahhariide kandvad proteiinid; peale lipoproteiinide rändab koos - fraktsiooniga veel rühm metalle siduvaid proteiine, nende hulgas vaske ja rauda trantsportiv transfertiin. - globuliinide heterogeenne fraktsioon sisaldab elektroforeetiliselt kõige aeglasemalt rändavaid proteiine, - globuliinide hulgas leidub enamik vere kaitse ja võitlusaineid. Füsioloogiline tähtsus: 1 lipiidide trantsport(fosfolipiidide), B11 siduv globuliin. 2 oksüdaasi aktiivsus, vase sidumine, plasmiini ja proteinaasi pidurdus, uriiniga mitteeritatava hemoglobiini sidumine. - raua trantsport, lipiidide (kolesterooli) trantsport. - immuunglobuiinid (antikehad bakteriaalsete antigeenide ja kehavõõra valgu vastu)
Transkriptsiooni aktivatsioonil on sageli oluline roll DNA bendingul (paindel). Näiteks lac promootori puhul on CRP-DNA kompleksis DNA oma sümeetriatelje suhtes 90° paindunud. Leiti, et kui asendada gal promootoril CRP seondumise sait DNA järjestusega, mis on looduslikes tingimustes paindunud (pikad polü-A järjestused), toimub transkriptsiooni aktivatsioon sellelt promootorilt ka ilma CRP-ta. 7 DNA bendingut on võimalik geel-elektroforeetiliselt tuvastada. Paindega DNA fragmendid liiguvad geelis aeglasemalt. Kõige aeglasemalt liigub geelis DNA fragment siis, kui paindumiskoht jääb fragmendi keskele. Lisaks -35 ja -10 heksameeridele on mõnede promootorite puhul leitud veel kolmas promootorelement - UP element. See on A-T rikas järjestus promootori -35 elemendist ülalpool. UP elemendi olemasolu on näidatud näiteks ribosomaalse rRNA geenide operoni rrnB promootoril P1 (regioon -40 kuni -60), flagelliini geeni promootoril B
fosfataasi ACP varianti, mida määravad kolm alleeli ACPA, ACPB ja ACPC. Nende kolme alleeli kombineerumise tulemusena võivad tekkida kuus erinevat genotüüpi. Aluselise fosfataasi A, B ja C vormid on funktsionaalselt sarnased, kuid erinevad oma liikuvuselt geelelektroforeesil, sest nende aminohappelises järjestuses on erinevusi. Kuue erineva genotüübi puhul on valkude elektroforeetiline pilt erinev. Kõigi kolme homosügootse variandi puhul on geelis elektroforeetiliselt tuvastatavad kaks erinevat, igale tüübile spetsiifilist valgubändi, sest samal polüpeptiidil on kaks konformatsiooni, mis liiguvad geelis erinevalt. Iga erineva genotüübi puhul on ACP aktiivsus erinev, püsides teatavas väärtuste vahemikus. Erinevate genotüüpide korral need väärtused osaliselt kattuvad. Analüüsides ACP aktiivsust kogu populatsioonis saame pideva kõvera, mis näitabki, et selle tunnuse fenotüübiline muutlikkus populatsioonis on pidev.
fosfataasi ACP varianti, mida määravad kolm alleeli ACPA, ACPB ja ACPC. Nende kolme alleeli kombineerumise tulemusena võivad tekkida kuus erinevat genotüüpi. Aluselise fosfataasi A, B ja C vormid on funktsionaalselt sarnased, kuid erinevad oma liikuvuselt geelelektroforeesil, sest nende aminohappelises järjestuses on erinevusi. Kuue erineva genotüübi puhul on valkude elektroforeetiline pilt erinev. Kõigi kolme homosügootse variandi puhul on geelis elektroforeetiliselt tuvastatavad kaks erinevat, igale tüübile spetsiifilist valgubändi, sest samal polüpeptiidil on kaks konformatsiooni, mis liiguvad geelis erinevalt. Iga erineva genotüübi puhul on ACP aktiivsus erinev, püsides teatavas väärtuste vahemikus. Erinevate genotüüpide korral need väärtused osaliselt kattuvad. Analüüsides ACP aktiivsust kogu populatsioonis saame pideva kõvera, mis näitabki, et selle tunnuse fenotüübiline muutlikkus populatsioonis on pidev.
annaabi.ee 
