Vaatlus 1. Tualettruumi ukselink Esimene päev: Peale kuue tunni möödumist oli märgata valge-kollaka täppide ilmnemist (5 täppi.) Nädala keskel: Nelja päeva möödudes esines ebameeldiva lõhna tekkimine petri tassist. Petri tassil oli kolm suurt, diameeter umbes 2 cm, kollakas-hallikat bakterite kogumit, ümbritsetuna valge-hallika täppide massist ning domineeris ka üks pea kolme sentimeetrise läbimõõduga rohekas bakterikoloonia mass. Viimane päev: Bakterite koloonia oli veidike tagasi tõmbunud. Koloonia oli stabiliseerunud, kuna toitaine puuduse tõttu ei saanud populatsioon enam kõrgemale tõusta. Lisandunud oli kahe laigu ühildumine, mis muidu seisid üksteisest eraldi. 2. Sissekäigu uks Esimene päev: Peale 9 tunni möödumist al. katse alustamisest võis näha ühe väikse hallika laigu esinemist. Nädala keskel: Möödunud on neli päeva vaatluse algusest ja tulemused pole esimesest
Bakterrakk on hoploidne. Bakterirakul puudub tuumamemrbaan. Plasmiidid on iseseisvad DNA rõngas molekulid, mis määravad mitmesuguseid raku omadusi. (Diplodine 46, hoplodine 23) 5) Eosed ehk endospoorid Moodustavad osad bakterid väliskeskkonnas eksisteerimiseks. Taluvad keetmist 30-40 minutit. 6) Bakterite suurus Eri bakteri liikide rakud on eri suurusega 0,5-3 mikromeetrit Bakterite kasv ja paljunemine Raku mõõtmed muutuvad väga vähe. Kasv = bakterikoloonia kasv, rakkude hulga suurenemine. 1. Bakteri rakk suureneb 2. Toimub rõnguskromosoomi replikatsioon 3. Toimub plasmiidide arvu suurenemine 4. Rakukest ja membraan sopistuvad 5. Moodustub rakuvahele sein 6. Bakterirakk jaguneb kaheks tütarrakuks. Generatsiooniaeg Ajavahemik, mis kulub bakterite populatsiooni rakkude arvu kahekordistumiseks. Generatsiooniaeg on in vivo ( elus) ja in vitro (katseklaasis) täiesti erinevad. Soodsates
Katseklaasi peale paneme fooliumi. · Jätame kõik kolooniad kasvama 37 kraadi juures. Minu Peetri tassis oli 3 valget kolooniat numbritega 4, 5, 6. Edasi oma töös kasutan 6-nda kolooniat. Lisaülesanded: 2.1) Võrdle antud transformatsiooni protokolli (mis on kasutusel GTI Molekulaarbioloogia laboratooriumis) DNA kokaraamatus tooduga. Millised on erinevused? Me teeme transformatsiooni 37 kraadi juures, Sambrook´i raamatus 42 kraadi juures. 2.2) Millisel juhul võib bakterikoloonia sisaldada rekombinantset plasmiid, kuid samas koloonia värvus on ikka sinine. Kuidas määrata, et selles koloonias on rekombinantne plasmiid? Bakterikoloonia võib sisaldada rekombinantset plasmiid, kuid samas koloonia värvus on ikka sinine, juhul, kui insert on väga väike ja ei muuda lugemisraami või kui järjestuses ei ole Stop-koodonit. PCR, ühe või teise praimeriga sekveneerida järjestus, restriktsiooniga on võimalik määrat ,et selles koloonias on rekombinantne plasmiid. 5 2
streptobatsill, kobar kokobatsill nii kera- kui pulkbakter - spiraalsed bakterid e spirillid, lainelised - keeritsbakterid e spiroheedid, kruvi kujuga - punguvad ja jätketega bakterid sarnanevad seentele, võivad tekkida ka viljakehad - niitjad bakterid, väga pikad Paljunemine. * paljunevad pooldudes, toimub DNA replikatsioon * aega, mis kulub bakterikoloonia kahekordistumiseks, nimetatakse generatsiooniajaks * niitbakterid paljunevad tükikestega * konjugatsioon enne pooldumist võivad bakterirakud vahetada geneetilist informatsiooni, kleepuvad kokku * sporulatsioon e spoori teke kehvade tingimuste ületamiseks Bakterite ainevahetus. * omastavad toitu remootselt kogu kehaga, energia salvestatakse ATP-na * makromolekule omastada ei suuda, bakter eraldab välikeskkonda ensüüme, mis neid lagundavad
) ja vali üks valge koloonia minipreparatsiooniks (vt. järgmine töö). Need kolooniad tuleb 1,8 ml LB vedelsöötmesse kasvama panna praktikumi-eelsel päeval (kontakteeru ses suhtes juhendajaga). Lisaülesanded: 2.1) Võrdle antud transformatsiooni protokolli (mis on kasutusel GTI Molekulaarbioloogia laboratooriumis) DNA kokaraamatus tooduga. Millised on erinevused? Meie inkubeerime 5min 37 kraadi juures, kokaraamatus 1,5min 42 kraadiga. 2.2) Millisel juhul võib bakterikoloonia sisaldada rekombinantset plasmiid, kuid samas koloonia värvus on ikka sinine. Kuidas määrata, et selles koloonias on rekombinantne plasmiid? Avatud lugemisraam, stop-koodon puudub või kui initsiatsioon algab meie inserdist. Määrata saab restriktsiooniga, kui multikloneerimissaidis on restriktaas SacII. 2.3) Mis juhtub, kui jätta Amp panemata? Võivad hakata kasvama muud bakterikolooniad, mitte plasmiidi sisaldavad bakterid. Meile olulised
oleks saanud kuidagi enda bakterikoloonaid eristada. Viga saaks parandada hõõrudes X-galiga tassi. Praktiline töö nr. 7: Minipreparatsioon aluselise lüüsi meetodil Eesmärk: Bakterites paljundatud plasmiidi välja puhastamine Materjalid: 1,5 ml LB vedelsööde Kasvatame baktereid vedelsöötmes, et neid aereerida. Sisaldab ka antibiootikumi. Valge bakterikoloonia 200 µl Lahus E1 Hoiab rakke elus. 200 µl Lahus E2 Muudab lahuse aluseliseks 200 µl Lahus E3 Normaliseerib pH 420 µl Isopropanool Sadestab 200 µl Etanool Peseme soolad välja Töö käik: Paneme valged kolooniad vedelsöötmesse kasvama. Inkubeerima 37 kraadi juures 16h.
Petri tassidele ning jätsime tarduma. Antibiootikumina kasutasime ampitsilliini, kuna transformeeritavas plasmiidis on ampitsilliini resistentsusgeen, mis võimaldab rakkudel, milles transformeerimine on õnnestunud, kasvama ja paljunema hakata. Oleks saanud kasutada ka kanamütsiini, kuna plasmiidis on ka kanamütsiini resistentsusgeen, kuid ampitsilliini kasutamine on vähem komplitseeritud. 5. DNA minipreparatsioon: a. Bakterikoloonia on bakterite kogum, mis tekib ühe bakteriraku paljunemisel. b. Petri tassil oli 25 kolooniat, neist 4 valged. Vedelsöötmesse panin kasvama ühe valge koloonia, kuna koloonia valge värv näitab, et nendes rakkudes on plasmiid, milles lacZ operoni lugemisraam on inserdi poolt rikutud vastasel korral sünteesitaks rakkudes dikloro-dibromo-indigod ning kolooniad oleks sinised. c. Minipreparatsiooni protokoll: 1
6. Fuugisin bakterid põhja 2 minutit. Tekkis sade rakkudest, mille pealt tuleb sööde ära valada. Tuubi jäi umbes 100 μl. 7. Pipeti abil kandsin bakterid Peetri tassile (tardunud söötmele) ning kuulikeste abil loksutasin bakterid ühtlaselt laiali. Asetasin tassid inkubaatorisse üleöö kasvama. Pärast säilitakse neid +4 °C juures järgmise nädalani. Minu Peetri tassil kasvasid üles umbes 3 valget kolooniat. Bakterikoloonia on üks bakter ja suur arv tema koopiaid. 8. Enne järgmist praktikumi tuleb panna saadud valged kolooniad kasvama. Selleks kasutasin eppendorfi, mille korgi sisse torkasin õhuaugu. Valasin 1 ml vedelsöödet (840 μl LB söödet), mis sisaldab 160 μl Amp-i (algne konts. 100 mg/ml) ning pipeti otsiku abil lisasin baktereid minu kolooniast (ühest, tähistasin seda Peetri tassil). Asetasin tuubid kasvama 37 °C inkubaatorisse. 53. 54
Astmef-i diferentseerumise reegel: y(x)=ax(n). kuupbarabool: y=bx3. 168. Pöördvõrdeline sõltuvus: y=a/x. 169. Hüperboolne sõltuvus: voolutugvus juhtme takistusest, liikumiseks kulunud aja sõltuvus kiirusest. Energiavälja muutumise kiirus on jõud. 170. Pöördvõrdeline ruuts: y=a/x2. Punktikujulise laengu v massi elektri- v gravitatsioonivälja tugevuse (jõu) sõltuvus kaugusest. 171. Eksponentsiaalne s: y=a(astm.x) (posit astmenäitaja: bakterikoloonia kasv ajas, kapitali suurenemine), (neg: radioaktiivselt lagunevate tuumade arv, valguskvantide arvu vähenemine). 172. Diferentsiaalvõrrand seob suuruste muutusi. Integreerimine dif.pöördf. Ja tuletise kaudu f-i otsimine. Vektorid on samad: kui sama siht suund pikkus. 173. Skalaarkorrutis: tulemuseks skalaar. Skal.korrutis on kommutatiivne. Ristiolevate vektorite skalaarkorrutis on 0. 174
tekivad bakteripopulatsioonis spontaanselt ning ei ole antbiootikumi poolt indutseeritud, suudeti tõestada alles 1950-ndate alguses. Joshua ja Esther Lederberg võtsid 1952. a. kasutusele uue meetodi, jäljendkülvi (replica plating), mis võimaldab huvipakkuva tunnuse osas bakteripopulatsioonis korraga läbi testida palju individuaalseid rakke. Kui külvata piisavalt lahjendatud bakterikultuur tardsöötmele, moodustuvad sinna bakterikolooniad (iga bakterikoloonia agarsöötmel on ühe bakteriraku järglaskond). Jäljendkülvi abil on võimalik testida näiteks ka seda, kas bakteripopulatsioonis oli streptomütsiini resistentseid mutante enne bakterite kokkupuutumist streptomütsiiniga. Bakterikultuuri lahjendatakse sellisel määral, et lahjendatud kultuuri viimisel Petri tassil olevale tardsöötmele (agarsöötmele) moodustub ligikaudu paarsada üksikkolooniat. Külve tehakse paljudele Petri tassidele ja nii saadakse testimiseks palju üksikkolooniaid
tekivad bakteripopulatsioonis spontaanselt ning ei ole antbiootikumi poolt indutseeritud, suudeti tõestada alles 1950-ndate alguses. Joshua ja Esther Lederberg võtsid 1952. a. kasutusele uue meetodi, jäljendkülvi (replica plating), mis võimaldab huvipakkuva tunnuse osas bakteripopulatsioonis korraga läbi testida palju individuaalseid rakke. Kui külvata piisavalt lahjendatud bakterikultuur tardsöötmele, moodustuvad sinna bakterikolooniad (iga bakterikoloonia agarsöötmel on ühe bakteriraku järglaskond). Jäljendkülvi abil on võimalik testida näiteks ka seda, kas bakteripopulatsioonis oli streptomütsiini resistentseid mutante enne bakterite kokkupuutumist streptomütsiiniga. Bakterikultuuri lahjendatakse sellisel määral, et lahjendatud kultuuri viimisel Petri tassil olevale tardsöötmele (agarsöötmele) moodustub ligikaudu paarsada üksikkolooniat. Külve tehakse paljudele Petri tassidele ja nii saadakse testimiseks palju üksikkolooniaid
annaabi.ee 
