kus: C1 taandavate suhkrute sisaldus aja hetkel T võetud proovis, mg C2 taandavate suhkrute sialduse 0 proovis, mg V1 hüdrolüüsisegu üldmaht, ml 1000 tegur üleminekuks mikrogrammidele T hüdrolüüsi kestus, s 180 glükoosi moolmass V2 proovi maht taandavate suhkrute määramiseks, ml V3 uurimiseks võetud invertaais lahuse maht, ml. Töö käik. 1. 100 ml koonilisse kolbi pipeteeritakse 25 ml 7%- list sahharoosi lahust, mille ph on 4,8 (reguleeritud atsetaatpuhvri abil). Lahus asetatakse vesitermostaati 30ºC juurde soojenema (5- 10 min). Tehakse ka uuritav invertaasi lahus. selleks kaalutakse 0,0208 g tahket invertaasi ja lahustatakse seda atsetaatpuhvris 5 ml-ni (pH = 4,8). 2. Kolme koonilisse kolbi mahuga 250-300 ml pipeteeritakse 10 ml komplekslahust. 3. 5-10 min. pärast sahharoosi lahusele lisatakse 0,5 ml uuritavat invertaasilahust., loksutatakse ja
Cu2O, mis eraldub reaktsioonisegust punase sademena ja lahusesse jääb ekvivalentses koguses vaba triloon B. Reaktsioonil vabanenud triloon B määratakse tiitrimisel 0,02 M vasksulfaadi lahusega, kasutades indikaatorina mureksiidi vesilahust. Invertaasi aktiivsus avaldatakse mikrokatalites 1 ml ensüümilahuse kohta. (µkat/ml). TÖÖ KÄIK Sahharoosi hüdrolüüsi läbiviimiseks võeti 50 ml katseklaas, kuhu pipeteeriti 25 ml 7 % sahharoosi lahust (substraati), mille pH oli atsetaatpuhvri abil reguleeritud sobivale väärtusele. Lahus asetati termostaati 30oC juures soojenema kümneks minutiks. Valmistati ette kolvid taandavate suhkrute sisalduse määramiseks. Selleks pipeteeriti kolme koonilisse kolbi mahuga 250 ml ~10 ml komplekslahust. 30oC termostateeritud sahharoosi lahusele lisati 0,5 ml eelnevalt valmistatud uuritava invertaasi invertiini lahust. Loksutati ja fikseeriti ensüümireaktsiooni alguse aeg kella järgi.
punase sademena ja lahusesse jääb ekvivalentses koguses vaba triloon B. Vabanenud triloon B kogus määratakse 0,02 M vasksulfaadi lahusega tiitrides, indikaatoriks mureksiid. 1 kat on ensüümi hulk, mis produtserib 1 s jooksul 30C juures 1 mol taandavat suhkrut (kutsub esile 1 mol sahharoosi hüdrolüüsi). Töö käik: Sahharoosi hüdrolüüsi läbiviimiseks võtsin 50 ml katseklaasi, kuhu pipeteeritisin 25 ml 7 % sahharoosi lahust (substraati), mille pH oli atsetaatpuhvri abil reguleeritud sobivale väärtusele. Lahuse asetasin termostaati 30°C juures soojenema kümneks minutiks. Valmistasin uuritava invertaasi lahuse: kasutasin vedelat invertaasi . Võtsin seda 0,3 ml, invertaasi lahust kokku oli 9 ml. Valmistasin ette kolvid taandavate suhkrute sisalduse määramiseks. Selleks pipeteerisin kolme koonilisse kolbi mahuga 250 ml 10 ml komplekslahust. Substraadi lahusele lisasin 0,5 ml eelnevalt valmistatud uuritava invertaasi lahust
Lahustina kasutan atsetaatpuhver pH väärtusega 4.8. Invertaasi kontsentratsioon on 5mg/ml ja lahuse maht on 10 ml tuleb kaaluda analüütilisel kaaludel 50 mg (0,05 g) tahket invertaasi. Selleks, et valmistada töölahust tuleb: · Loputada kaaluklaasi väikese kogusega atsetaatpuhver lahusega. · Kaaluda analüütilisel kaaludel kaaluklaasi ilma ensümideta. · Kaaluda vajalik ensüümi kogus. · Valada ensüüm gradueeritud katseklaasi ja lisada vajalik atsetaatpuhvri kogus. · Segada klaasi sisu umbes 5 min. Klaaspulgaga,kuni ühtlase suspensiooni moodustumiseni. Ensüümireaktsiooni (sahharoosi hüdrolüüsi) läbiviimine 1) Võtan 50 ml mahuga katseklaas,kuhu pipeteerin 25ml substraati,milleks on 7%-line sahharoosi lahus atsetaatpuhvris pH väärtusega 4,8. Katseklaas varustan fooliumiga ja asetan umbes 10 minutiks vesitermostaati 30 ºC juurde soojenema.
sademena ja lahusesse jääb ekvivalentses koguses vaba triloon B. Reaktsioonil vabanenud triloon B määratakse tiitrimisel 0,02 M vasksulfaadi lahusega, kasutades indikaatorina mureksiidi vesilahust. Invertaasi aktiivsus avaldatakse mikrokatalites 1 ml ensüümilahuse kohta. (µkat/ml). Töö käik 1. Sahharoosi hüdrolüüsi läbiviimiseks võetakse 50 ml katseklaas, kuhu pipeteeritakse 25 ml 7%- list sahharoosi lahust(substraati), mille pH on 4,8 (reguleeritud atsetaatpuhvri abil). Lahus asetatakse vesitermostaati 30ºC juurde soojenema (5-10 min). Tehakse ka uuritav invertaasi lahus. selleks kaalutakse 0,025 g tahket invertaasi ja lahustatakse seda atsetaatpuhvris 5 ml-ni (pH = 4,8). Ensüümi kontsentratsioon lahuses tahkel preparaadil on 5mg/ml kohta. 2. Valmistati ette kolvid taandavate suhkrute sisalduse määramiseks. Selleks pipeteeriti kolme 3. koonilisse kolbi mahuga 250 ml ~10 ml komplekslahust. 4. 5-10 min
Vajalikud ained - 9,5 mg tahket invertaasi - 2,4 ml atsetaatpuhvrit (pH = 4,8) 4 3.1 Invertaasi aktiivsuse määramine Martin Tamm (121006YASB) Biokeemia protokoll Töö käik 1. Kasutades analüütilist kaalu, kaaluda ära 9,5 mg tahket invertaasi väiksesse keeduklaasi. 2. Kanda üle invertaasi gradueeritud katseklaasi ja panna katseklaasi 2,4 ml atsetaatpuhvri lahust. 3. Klaaspulga abil läbi segada lahus kuni tekib ühtlane hägusus ja suspensioon (tükid võivad sees olla). 4. Gradueeritud katseklaasile panna kork peale ja ettevaatlikult läbi loksutada katseklaasi sisu. Ensüümi ja puhvri vaheline seos tahke invertaasi puhul on 1 mg tahket invertaasi ja 4 ml puhverlahust. Ma võtsin 9,5 mg tahket invertaasi ja 2,4 ml puhvrit. m(tahke invertaas) = 9,5 mg V(puhverlahus) = 2,4 ml 2
annaabi.ee 
