Nukleiinhapete hübridiseerimine: amplifitseerimise korral nimetatakse oligonukleotiidi praimeriks, hübridiseerimisel sondiks. Ahelad keeratakse lahti ja kui on sondile komplementaarne järjestus, siis renaturatsiooni puhul see lühike sond seondub eelistatult DNA ahelaga, sest alati lühike nukleotiidi järjestus seondub pika ahelaga paremini kui kaks pikka ahelat omavahel. INNO-LIPA hübriidimise meetod: amplifitseeritakse DNA, kasutades biotiin-märget (biotinoleeritud nukleotiidid), mis seob streptavidiini tekkiv kompleks on üks tugevamaid bioloogilisi interaktsioone. Streptavidiini küljes on veel fosfataas värvireaktsiooni läbi viimiseks. Peale amplifikatsiooni viiakse see kõik testribale, kus iga triip vastab ühele järjestusele. Hübridisatsiooni korral tekib värvireaktsioon. *Sondi pikkus (mida lühem sond, seda suurem võimalus leida temale vastavaid
põlvkonna meetoditest: a) Sekveneeritavat DNA-d ei amplifitseerita vaid järjestatakse otse reaal-ajas b) DNA sekveneerimiseks tekitatakse ensümaatiliselt erineva pikkusega fluorestsentsmärgisega fragmentide jadad, mis lahutatakse elektroforeesil c) DNA sekveneerimine toimub kloonide kaupa d) Kogu sekveneeritav DNA purustatakse, saadud fragmentidele liidetakse praimerid ning amplifitseeritakse sild- amplifikatsioonil kiibi pinnal 13. Restriktaas HindIII lõikab DNA-d järgmisest äratundmiskohast 5'AAGCTT3'. HindIII on seega: a) Tüüp 1 restriktaas, mis annab DNA lõikamisel 3' üleulatuva otsa b) Antud ensüüm annab DNA lõikamisel tömpotsa c) Tüüp 2 restriktaas, mis annab DNA lõikamisel 5' üleulatuva otsa d) Tüüp 1 restriktaas, mis annab DNA lõikamisel 5' üleulatuva otsa
fill-in meetodit, konstrueerida sünteetiline geen ning see kloonida, sekveneerida ja ekspresseerida E.colis. Kuidas erinevaid etappe analüüsitakse? Oligonukleotiide sünteesitakse keemiliselt nii, et nenda otsad kattuksid omavahel. Nii need oligonukleotiidsed ahelad seovad omavahel ning kasutades DNA polümeraasi I ja Klenow fragmenti, dNTP olemasolul võib sünteesida kaksikahelat. Seda sünteetilist järjestus amplifitseeritakse PCR abil, lisades praimeri (forward ja reverse), Mg (katalüsaator), dNTP-d, Taq polümeraasi (teostab sünteesi kõrgel temperatuuril). PCR käigus toimub ahelate denatureerimine, praimeritega seondumine ja süntees. Seda tsüklit korratakse 30 korda. Seda etappi kontrollitakse kasutades elektroforeesi. Järgmisena toimub selle järjestuse ja vajaliku vektori töötlemine. Sõltuvalt sellest, mis otsad tahetakse saada (,,blunt" või ,,sticky") kasutatakse vastavalt vajalikud restriktaase
IsoCode kaart FTA kaart 9.STR markerite multiplex analüüs fluorestsentsmärgiste kaudu (mis on multiplex analüüs, miks fluorestsenstsmärgised, milline märkimisviis). Multiplex PCR: -Samaaegselt võimalik kopeerida üle 10 markeri -Tundlikkus alla 1 ng DNA-d -Võimalik analüüsida segaproove ja deradeerunud proove -Erinevad flourestsentsmärgised võimaldavad teha vahet sama pikkusega STR alleelide vahel -Praimerite valik/disain ülioluline -10 või enam STR lookust amplifitseeritakse samaaegselt -STR kitid müügil Väljakutsed -Praimerite disainimine (pole programme) 17 -reaktisooni optimiseerimine katse-eksituse meetodil, võtab aega Multipleks PCRi eelised -Ajaühikus saadakse rohkem infot -Väiksem töökulu tulemuste saamiseks -Vaja vähem proovi 10.Pikkusmarkerid ja alleelsed redelid STR alleelide kindlaktegemisel (mida endast kujutavad, miks on vaja). DNA polümorfismide tüübid: -Järjestuse polümorfism
olulisemad andmed Eesti elanike tervisliku seisundi (terviseandmed), sugupuude (genealoogilised andmed) ja eluviisi ning keskkonnafaktorite kohta. Fenotüpiseerimiseks vajaliku andmekogumisega paralleelselt võetakse projektis osalejalt ka vereproov. Genotüpiseerimiseks vajalik DNA eraldatakse verest. Täiskasvanutelt võetakse 50 ml veeniverd (7-18 a. lastelt 20 ml), mis toimetatakse kesklaboratooriumisse, kus eraldatakse DNA ja plasma. Genotüpiseerimiseks DNA amplifitseeritakse ja määratakse markerlookused (SNP), kasutades primeri pikendamise (primer extension) tehnoloogiat. Genotüpiseerimise tulemusena tekib andmebaas e. geneetiline kaart 60 000 - 100 000 markerlookuse kohta miljonil isikul, mida oleks võimalik kasutada linkage disequilibriumi (geneetilise lookuse tasakaalustamata aheldatus) baasil assotsiatsiooniuuringuteks. Pärast analüüside tegemist ja andmete sisestamist andmebaasi analüüsitakse genotüüpide
süntees DNA polümeraasi ja dNTP-de lisamisega. qPCR – DNA ja RNA paljundamiseks. Hinnatakse automaatselt kohe tekkiva amplifikatsiooni produkti hulka. Kasutatakse fluoressentsi detekteerivat termotsüklerit. Kasutatakse geeni ekspressiooni hindamiseks ning mutatsioonide ning SNPde leidmiseks RT-PCR – reverse transcriptase PCR, RNA kopeeritakse pöördtranskriptaasi kasutades cDNAks, seega vaja mRNAd. cDNA amplifitseeritakse Alleelspetsiifiline PCR – praimeri 3’ ots on disainitud nii, et see seostuks täpselt mutatsiooni kohta. Kui ei seondu, ei ole mutatsiooni DNAd võib kloneerida kasutades spetsiaalseid rakkuliine, selleks on vaja tüüp II restriktsiooni endonukleaase. Restriktaasid tunnevad ära kindlaid palindroomseid (järjestus on mõlema ahela 5’-3 suunas sama) DNA järjestusi ja on võimelised neid kindlas piirkonnas
99. DNAd saab edasi kasutada genotüüpiseerimiseks, mingite lõikude amplifitseerimiseks, kloneerimiseks jne. 100. 101. RNA eraldamine imetajarakkudest 102. RNA eraldamiseks kasutatakse tänapäeval enamasti spetsiaalseid komplekte ehk kitte. Kasutatakse ka vedelat lämmastikku. RNA eraldamisel on väga oluline hoida puhtust, sest RNAaase on peaaegu igal pool ja RNA laguneb suhteliselt kergesti. 103. RNAd kasutatakse enamasti cDNA sünteesiks ja seda omakorda amplifitseeritakse, et määrata erinevate mRNA-de ekspressioonitasemeid rakkudes. 104. 105. Valkude eraldamine imetajarakkudest 106. Valkude eraldamiseks lüüsitakse rakud pehmemates tingimustes kui DNA eraldamisel. Lüüsipuhver peab sisaldama puhverdavaid aineid, mis hoiavad pH enam-vähem neutraalse (Tris-HCl, HEPES-NaOH), NaCl osmootse tasakaalu säilitamiseks (100-500 mM), detergenti membraanide lahustamiseks (SDS, Triton X-100, NP-40), lisaks veel glütserooli, vajadusel
kloneerimiseks jne. RNA eraldamine imetajarakkudest RNA eraldamiseks kasutatakse tänapäeval enamasti spetsiaalseid komplekte ehk kitte. Võib kasutada ka Trizol vms. reagenti, mille põhimõte on RNA ekstraheerimine guanidiin- isotiotsüanaadi ja fenool-kloroformiga. Kasutatakse ka vedelat lämmastikku. RNA eraldamisel on väga oluline hoida puhtust, sest RNAaase on peaaegu igal pool ja RNA laguneb suhteliselt kergesti. RNAd kasutatakse enamasti cDNA sünteesiks ja seda omakorda amplifitseeritakse, et määrata erinevate mRNA-de ekspressioonitasemeid rakkudes (qPCR). Valkude eraldamine imetajarakkudest Valkude eraldamiseks lüüsitakse rakud pehmemates tingimustes kui DNA eraldamisel. Lüüsipuhver peab sisaldama puhverdavaid aineid, mis hoiavad pH enam-vähem neutraalse (Tris-HCl, HEPES-NaOH), NaCl osmootse tasakaalu säilitamiseks (100-500 mM), detergenti membraanide lahustamiseks (SDS, Triton X-100, NP-40), lisaks veel glütserooli, vajadusel EDTA-d või muid lisandeid
etambutooli suhtes. Alates oktoobrist 2004 testitakse tüvesid ka pürasiinamiidi suhtes. 28 Reservrea ravimitest määratakse tundlikkus amikatsiini, kanamütsiini, ofloksatsiini, protioonamiidi, kapreomütsiini suhtes. Mycobacterium tuberculosis’e kompleksi samastamine koos ravimitundlikkuse määramisega isoniasiidi ja rifampitsiini suhtes- MTBDR plus test HAIN Lifescience GenoType, kus amplifitseeritakse neid geeni piirkondi, mis vastutavad kahe põhilise tuberkuloosiravimi - isoniasiidi ja rifampitsiini - ravimtundlikkuse eest. Mutatsioonid kindlates geenides viitavad resistentsusele nimetatud ravimite suhtes. Testi saab teostada nii mükobakterite puhaskultuurist kui ka bakterioskoopial positiivse tulemuse andnud algmaterjalist. Mycobacterium tuberculosis’e kompleksi samastamine koos ravimitundlikkuse määramisega
Bakterite puhul on kokku leitud 56 suuremat alamjaotust, nendest 26 on kultiveeritavate esindajatega. Puudub korrelatsioon flogeneetiliste rhmade ja fenotbiliste tunnuste (feneetilise ssteemi) vahel. Mikroobikoosluste uurimisel rakendatavad molekulaarsed meetodid vib laias laastus jagada kaheks: osaliseks ja tielikuks koosluse DNA analsiks (partial and whole community DNA analysis). Osalise analsi puhul keskendutakse vaid osale genoomist, markergeenidele, mis amplifitseeritakse PCR-i meetodi abil. Tieliku koosluse analsi puhul ptakse uurida kogu informatsiooni, mida eraldatud DNA sisaldab. Probleemid molekulaarsete meetodite kasutamisel: DNA-l phinevad meetodid sltuvad DNA eraldamise kvaliteedist. Erinevad bakterid lsuvad erinevalt, seega on vimalik et osa bakterirakke ei lsu ldse, seega jb osa bakterite DNA-st keskkonnast eraldamata. Praimerite jrjestused, mida kasutatakse polmeraasahelreaktsioonis, on koostatud publitseeritud
regulatsiooni inimese rakus. See vähendab insuliini retseptorite arvu. Inimene muutub resistentsemaks seetõttu, et hormooni tundlikkust vähendatakse. Nt2. ala-regulatsioon samal juhtumil. Tüüp2 diabeediga inimene saab suurendada oma tundlikkust insuliinile läbi korraliku dieedi ja regulaarse trenniga, seega kaotades kaalu; mõned võivad isegi naaseda oma diabeedi eelsesse olekusse jälgides sellist reziimi. 11. Kuidas väliskeskkonnast tulnud signaal amplifitseeritakse rakus vastusena üles? Väliskeskkonnast tulnud signaal käivitab rakus esialgse vastuse- geeni ekspressiooni. Ekspresseeritud geenide hulgas aga võib olla ensüüme ja transkriptsioonifaktoreid, mis omakorda aktiveerivad teisi geene. Tekib aktivatsiooni-kaskaad, mille tagajärjel hakatakse mingit valku tootma (vastuseks väliskeskkonna signaalile). 12. Miks on vaja rakusisest kompartmentaliseeritust ja signaali ülekannet? Too näiteid, mis rakuga
annaabi.ee 
