N. DNA värvid propiidiumjodiid, Hoechst, DAPI jt • Immuunofluorestsents – kasutatakse fluorestseeruva märgisega (FITC, Alexa, Cy jt) konjugeeritud antikehasid. Enamasti tehakse kahekihiline reaktsioon, esmalt kasutatakse uuritava valgu vastaseid primaarseid antikehasid ja seejärel fluorokroomiga konjugeeritud sekundaarseid antikehi, mis seostuvad primaarse antikeha konstantsete regioonidega. See võimaldab signaali amplifitseerimist, sest ühe primaarse antikehaga saab seostuda mitu sekundaarset antikeha. Samuti kaob siis ära vajadus iga primaarse antikeha fluorokroomiga konjugeerimiseks. Esimene päev – rakkude fikseerimine Enne antikehadega värvimist tuleb rakud fikseerida, ehk töödelda neid kemikaalidega, mis peatavad neis bioloogilist protsessi, seega ka lagunemist. Rakud muutuvad vastupidavamaks. Antud juhul fikseerimiseks kasutame PFA lahust, kuid saab fikseerida ka teiste meetoditega,
N. DNA värvid propiidiumjodiid, Hoechst, DAPI jt Immuunofluorestsents – kasutatakse fluorestseeruva märgisega (FITC, Alexa, Cy jt) konjugeeritud antikehasid. 143. Enamasti tehakse kahekihiline reaktsioon, asmalt kasutatakse uuritava valgu vastaseid primaarseid antikehasid ja seejärel fluorokroomiga konjugeeritud sekundaarseid antikehi, mis seostuvad primaarse antikeha konstantsete regioonidega. See võimaldab signaali amplifitseerimist. 144. 145. Esimene päev – rakkude fikseerimine 1. Valmistada vajalikud lahused: Fikseerimislahus: 4% PFA 1x PBSis, 10 ml (oli valmis) 146. 0,4 g PFA puru + 1 ml 10x PBSi + 9 ml vett 1x PBS, 50 ml 147. 5 ml 10x PBSi + 45 ml MQ, segada PBS-Tween: 1x PBS, millele on lisatud 0,05% Tween 20, 50 ml 148. 5 ml 10x PBSi + 45 ml MQ + 50 μl Tween 20
KORDAMISKÜSIMUSED Talpsep 1. Millisel juhul on LCR eelistatud meetod PCR ga võrreldes LCR on suurema spetsiifilisusega kui PCR. Seda on kaval kasutada tuntud järjestuste ja punktmutatsioonide tuvastamiseks kui kasutada oleva DNA kogus on limiteeritud. 2. Milline meetod võimaldab RNA amplifitseerimist DNA juuresolekul? NASBA on RNA tuvastamiseks eriti hea meetod: RNA ahelale saab panna pöördtranskriptaasiga praimeri juurde, sünteesitakse uus ahel, RNAas lõhutakse H-ga ära ja sünteesitakse uuesti jne kuni saadakse detekteeritav kogus nukleiinhappe molekule. Tal on ka see omadus, et töötab DNA juuresolekul ei pea proovi ära puhastama, mis RNA puhul on väga keeruline. Kasutatakse ka ekspressiooniproduktide määramiseks. 3
5% inimesel). Merisiilikul on näiteks igal ajahetkel vaid ~6% unikaalsetest järjestustest transkriptsioonil. Diferentseerunud kudedes vaid 0,8% genoomist ekspresseeritakse. Ega me veel praegu ei tea "junk" DNA rolli, võimalik et see ei ole ainult kasutu. Molekulaargeneetika meetodid (I) 1. Amplifitseerimine (Polümeraasi ahela reaktsioon -PCR) 2. DNA sekveneerimine ehk järjestamine 3. DNA Fingerprinting 4. Ühe nukleotiidi polümorfism (SNP) Kuidas PCR töötab: DNA koos amplifitseerimist vajava lõiguga ja kaks sünteetilist oligonukleotiidist praimerit, mis on komplementaarsed lõigu algustega. Denatureerime DNA kaksikahela üheahelaliseks kuumutades 94°C. Kiiresti jahutada DNA (37-65°C) ja liita praimerid soovitava lõigu otsa külge (komplementaarne otsa nukleotiidiga). Nüüd ahela süntees 70-75°C juures kasutades termo-resistentset DNA polümeraasi (nn. Taq polümeraas saadud Thermus aquaticus'elt). Sama protseduuri (denaturatsioon, liitmine ja ahela süntees)
annaabi.ee 
