Pürosfaat on substraadiks erinevate reaktsioonide toimumiseks, mille tulemusel vabaneb valguskiirus, mis registreeritakse ja tänu millele saab järjestada terve ahela. Illumina Solexa tehnoloogia puhul algab töö genoomse DNA fragmeteerimisega ultraheli vahendusel, mille tulemusel saadakse suhteliselt ühtlase pikkusega DNA segu. Seejärel liidetakse nende DNA lõikude otstesse adapteroligonukleotiidid ja puhastatakse. Nüüd järgneb DNA amplifitseerimine, mis Illumina platvormi puhul toimub tahkele kandjale seotult. Selleks kasutatakse nn. Flow-Cell-i, kus paiknevad adapteritega komplementaarsed oligonukleotiidid, millele liidetakse DNA fragmendid. Sildamplifikatsiooni tulemusena tekivad Flow-Cell põhja identse järjestustega DNA klastrid Sekveneerimiseks kasutatakse eemaldatava floresentsiga terminaatnukleotiide ja vastavat DNA polümeraasi. Ühe sekveneerimise tsükli kohta liidetakse üks
Molekulaarbioloogia edusammud on pakkunud alternatiive fenotüübilistel omadustel baseeruvatele meetoditele. DNA või RNA sedastamine uuritavas materjalis võimaldab otseselt uurida mikroorganismide geene (genotüübiline meetod), selle asemel et uurida mikroobi omadusi, mis sõltuvad geeni ekspressioonist. Nukleiinhapetel põhinevad meetodid Molekulaarsed diagnostikameetodid jagunevad kolme rühma: 1. hübridiseerimine, 2. amplifitseerimine (võimendamine või paljundamine) 3. nukeliinhapete ensümaatiline lõhustamine. Nukleiinhapete hübridisatsioon Hübridisatsioon põhineb nukleiinhapete komplementaarsuse printsiibil, s.t. kaks üheahelalist nukleotiidide ahelat ühinevad omavahel kaheahelaliseks nukleotiidahelaks – s.o. dupleksiks ehk hübriidiks vaid juhul, kui neid moodustavad nukleotiidid on komplementaarsed: adeniinile (A) vastab tümiin (T) ja tsütosiinile (C) guaniin (G)
detektsiooni. Põhinevad energia ülekandel, kus fluorestsents detekteeritakse tänu muutusele füüsikalises distantsis fluorokroomi ja vaigistaja vahel pärast proovide hübridisatsiooni. Iga SNP vajab spetsiaalpraimerit. Kõige efektiivsemad väheste SNP-de ja suure hulga proovide puhul. 18. Suure võimsusega genotüpiseerimise võimalused 1. (DNA) polümeraasipõhised ekstensioonitehnikad: 1. tillukse jupikese amplifitseerimine, kus on SNP sees. Üks ahel biotinoleeritakse, hiljem streptavidiiniga kerakestega püütakse välja. Streptavidiin on suur molekul, biotiin on tilluke vitamiin. Biotiin seostub väga afiinselt avidiinile ja streptavidiinile. Avidiini on väga palju munarebus, sest ta on antimikrobiaalne, sest ta seob biotiini. Biotiin on enamuse mikroobide elutegevuseks vajalik vitamiin. Järgmine aste:
genotüübist. Seega, kui meil oleksid nn geneetilised ravimid, mis toimivad vaid kindlate geenide ja genotüüpide puhul, oleks ravi kindlasti palju edukam. Personaalmeditsiini tungimine igapäevameditsiini on seniste teadsandmete põhjal veel kauge ootus. KOHTUMEDITSIINIS – inimeste tuvastamine DNA fingerprinting. Inimese DNAs on tohutult erineva pikkusega kordusjärjestusi. Praegu kasutatakse STR (short tandem repeat). Toimub STR-de amplifitseerimine PCR meetodil ja Sõltuvalt korduste arvust saadakse erineva pikkusega DNA fragmendid - Isaduse tõestamine - kohtumeditsiinis 2. Kaasaegse geneetika rakendusalad põllumajanduses. Transgeensed organismid. Organismi kloonimine. 1 Tänapäeval on paljud taimesordid geneetiliselt modifitseeritud, ehk need sordid sisaldavad lisageene. GMO – transgeenselt modifitseeritud organismid
polümorfismi - s.o. loodusest saadud suurused ei lange kokku NT poolt ennustatuga Molekulaarse kella kiiruse ja geneetilise varieeruvuse hindamisest Molekulaarse kella (MK) kiiruse mõõtmise klassikaline teooria loodi küll juba kuuekümnendail (Emil Zuckerkandl ja Linius Pauling), kuid just alles viimase 10 aasta jooksul on selle testimine muutunud võimalikuks massilis ulatuses (DNA amplifitseerimine + sekveneerimine). MK tiksumise kiiruse mõõtmiseks võetakse kaks liiki, mille lahknemise aeg on paleontoloogiast (fossiilide dateering) piisava tõepärasusega teada (!?). Valitakse nende liikide kaks ortoloogset geeni (valku) ja määratakse nukleotiidne (AH) järjestus. Loetakse kokku erinevused ja arvutatakse kiirus. Olgu meil hiir ja inimene, kes lahknesid ~ 80 MA eest. Olgu meil 100 AH pikkune valk ja olgu leitud erinevuste arv 16. Esiteks - tuleb aru saada, et aeg tuleb arvestada
Seejärel bakterirakud lüüsitakse ja DNA fikseeritakse filtrile. Märgistatud DNA-sondil lastakse reageerida (hübridi- seeruda) fikseeritud DNA-ga. Pärast mittehübridiseerunud DNA väljapesemist määratakse kindlaks reaktsiooniprodukt. Antud juhul, kasutades dip-stick-tehno- loogiat, bakteri märklaud-DNA püütakse kinni ning määratakse ELISA-ga (nt Gene-Trak®). PCR-tehnika on väga spetsiifiline ning kõrge tundlikkusega. Toimub spetsiifiliste geenide amplifitseerimine (kordades paljundamine) ning see metoodi- ka võimaldab määrata ka proovis väga vähesel hulgal esinevaid baktereid. Meetodi puuduseks on see, et teda võivad inhibeerida söötmetes ja toidus esinevad kompo- nendid, nt ensüümid ja hemoglobiini laguproduktid. Kaubanduses on saadaval PCR-l baseeruvad analüüsisüsteemid (nt Du Pont Bax®, Taqman®, Probelia®). Lisauuringuteks vajalikud toimingud. 1. Mikroskoopimine. Valgusmikroskoopiat kasutatakse:
(genoomi repressiooni/aktivatsiooni muster). Genoomi aktiivsus ontogeneesis: Enamus genoomi DNA-st ei kodeeri valku (junk DNA;~98.5% inimesel). Merisiilikul on näiteks igal ajahetkel vaid ~6% unikaalsetest järjestustest transkriptsioonil. Diferentseerunud kudedes vaid 0,8% genoomist ekspresseeritakse. Ega me veel praegu ei tea "junk" DNA rolli, võimalik et see ei ole ainult kasutu. Molekulaargeneetika meetodid (I) 1. Amplifitseerimine (Polümeraasi ahela reaktsioon -PCR) 2. DNA sekveneerimine ehk järjestamine 3. DNA Fingerprinting 4. Ühe nukleotiidi polümorfism (SNP) Kuidas PCR töötab: DNA koos amplifitseerimist vajava lõiguga ja kaks sünteetilist oligonukleotiidist praimerit, mis on komplementaarsed lõigu algustega. Denatureerime DNA kaksikahela üheahelaliseks kuumutades 94°C. Kiiresti jahutada DNA (37-65°C) ja liita praimerid soovitava lõigu otsa külge (komplementaarne otsa nukleotiidiga)
annaabi.ee 
