Kui esialgses reaktsioonis on 4 molekuli matriits DNA’d, siis mitu molekuli PCRi produkti on tekkinud pärast 25.tsükli lõppemist. Tehniliselt võiks mõelda et kui on 4 molekuli, siis see on 2 2. Ja tehtud on 2 ringi PCRi. Liidame selle 25le juurde ja saame tehniliselt 27 ringi, kui oleksime alustanud 1 molekuliga. 227=134217728 Praktiline töö nr. 2: Agaroosgeeli valamine Eesmärk: PCR produkti analüüsimiseks vajaliku agaroosgeeli valmistamine. Materjalid: 4,5g Agaroosi pulber Varieerides geeli agaroosisisaldust saame lahutada ka suhteliselt sarnaste pikkustega DNA fragmente. 300ml 1x TAE puhver lahusti 3µl EtBr DNA visualiseerimise reagent (lõppkontsentratsioon 0,05µg/ml) Arvutused: 1,5 0,05× 300
(7) Tsentrifuugi maksimaalsel kiirusel 8-10 min. Eemalda supernatant täielikult ja lahusta sade 100 l TE + Ribonukleaasi A (5 g/ml) lahuses (RNA lagundamiseks). Inkubeeri saadud lahust 37 oC juures ~30 min. Vt lisaülesanne 3.2. 1) suurem osa 1000 l pipetigakiirtsentrifuug 2) väiksema pipetiga eemaldasin ülejäänu supernatandi (8) Samal ajal valmista 1 x TBE 0,8% agaroosgeel DNA analüüsiks (grupi peale). Selleks on vaja 80 ml TBE puhvrit ja ... g agaroosi. Keeta mikrolaineahjus kuni agaroos on lahustunud. Jahutada vesivannis ja lisada DNA nähtavaks tegemiseks 1 l EtBr (5 g/l). Valada geel vormi, kuhu on varem valmis pandud nn ,,kamm" või ,,hambad". ~30 min pärast on geel tardunud. 8 (9) Peale 30 min inkubatsiooni teosta DNA-le fenooltöötlus. See on vajalik RNaasi eemaldamiseks. Selleks:
Sulge tuub ja sega intensiivselt (tekib plasmiidse DNA sade, RNA jääb osaliselt supernatanti). (7) Tsentrifuugi maksimaalsel kiirusel 8-10 min. Eemalda supernatant täielikult ja lahusta sade 100 l TE + Ribonukleaasi A (5 g/ml) lahuses (RNA lagundamiseks).Segame Vortexiga ja vuugime 1-2 minutit. Inkubeeri saadud lahust 37 oC juures ~30 min. Vt lisaülesanne 3.2. (8) Samal ajal valmista 1 x TBE 0,8% agaroosgeel DNA analüüsiks (grupi peale). Selleks on vaja 80 ml TBE puhvrit ja ... g agaroosi. Keeta mikrolaineahjus kuni agaroos on lahustunud. Jahutada vesivannis ja lisada DNA nähtavaks tegemiseks 1 l EtBr (5 g/l). Valada geel vormi, kuhu on varem valmis pandud nn ,,kamm" või ,,hambad". ~30 min pärast on geel tardunud. Punkt 9 jääb vahele. (9) Peale 30 min inkubatsiooni teosta DNA-le fenooltöötlus. See on vajalik RNaasi eemaldamiseks. Selleks: - lisa RNaasA-ga töödeldud DNA-le võrdses koguses fenooli (100 l) (tõmbe all!!!) - tsentrifuugi 1-2 min
Kaks tüüpilist foreesikeskkonda on: 1. Polüakrüülamiid 2. Agaroos Polüakrüülamiid on sünteetiline polümeer, mis moodustab poorse struktuuriga erineva läbimõõduga tunnelite labürindi. Kasutatakse lühikeste DNA/RNA fragmentide (5-500 bp) lahutamiseks. Polüakrüülamiidgeel elektroforees võib olla: • Vertikaalne ühedimensiooniline • Vertikaalne kahedimensiooniline • Horisontaalne Agaroos on lineaarne polümeer, mis koosneb D- ja L-galaktoosi jääkidest. Agaroosi ahelad moodustavad heeliksikujulised fiibrid, mis omakorda agregeeruvad 20-30 nm struktuurideks. Agaroosi geelistumisel moodustub 3-dimensiooniline kanalite (pooride) võrgustik, millede diameeter ulatub 50-200 nm. Agaroosgeeli on võimalik teha erineva suuruse ja poorsusega sõltuvalt DNA fragmentide suurusest, mida kavatsetakse lahutada. Agaroosforees on tehniliselt lihtsam ja kiiremini läbiviidav, aga agaroosi lahutuvus on väiksem kui polüakrüülamiidil
Afiinsuskromatograafia on kromatograafia liik, millega segu lahutamine toimub tänu kitsalt spetsiifilistele interaktsioonidele, nagu antigeen-antikeha, ensüüm-substraat või retseptor-ligand vastastoime. Afiinsuskromatograafiat kasutatakse mingi komponendi väljapuhastamiseks segust puhverlahusesse ja kontsentreerimiseks, mingi komponendi sisalduse vähendamiseks segus või ligandide otsimiseks. Statsionaarse faasina kasutatakse tavaliselt geelimaatriksit (enamasti agaroosi), kuhu on kinnitatud ligand, millele seostub spetsiifiliselt mingi uuritava segu komponent. Selles töös ma hakkan kasutama geelkromatograafiat, seega tahaks sellest täpsemalt kirjutada. 2.1 Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil Geelkromatograafia on üks kromatograafilist meetodist, mida kasutatakse erineva molekulmassiga ainete lahutamiseks. Kuna ainetel on erinevad molekulmassid liiguvad nad läbi poorsuse geeli
4. 72 °C 3 minutit – DNA süntees 5. Kordamine alates 2. punktist 21 korda 22. Selline sünteesiaeg valitakse sõltuvalt polümeraasist. HotFIRE Pol sünteesib keskmiselt 1 kb DNAd 1 minuti jooksul ning selline aeg valitakse nii, et kõik järjestused jõudsid paljuneda ( näiteks meil oli kõige pikem produkt – 2400 aluspaari). 23.DNA lahutamine agaroosgeelis 24. Eesmärgiks on visualiseerida oma produkti ning hinnata selle suurust. DNA lahutamisel kasutatakse agaroosi (disahhariid, koosneb D-galaktoosist ja 3,6-anhüdro-L-galaktoosist). 1. päev: kasutatava agaroosgeeli kangust arvutatakse võttes arvesse oodatava produkti pikkust. Meie kasutasime 1% geeli. Segasime kokku 100 ml TAE puhvrit, 1 gr agaroosi ning kuumutasime mikholaineahjus sulamiseni. Jahtunud geelisegule lisasime1 μl EtBr, mida kasutatakse DNA visualiseerimiseks. Valasime lahus geelialusele ning jätsime tarduma järgmise praktikumini. 2
replikatsiooni alguskohaks. 20. Kes töötas välja PCR meetodi? 2:2-3. PCR meetodi leiutas 1983 Kary Mullis. 21. Mis on geel-elektroforees ja milleks seda kasutatakse? 2:11-15. Elektroforees on meetod mis võimaldab eri tüüpi molekule üksteisest lahutada järgnevate karakteristikute järgi: elektriline laeng, suurus, kuju. Geel-elektroforeesi kasutatakse DNA molekulide isoleerimiseks. Geeliks kasutatakse agarist puhastatud suhkrut agaroosi. Agaroosil on poorjas struktuur mis takistab DNA fragmentide vaba liikumist ja seega lahutab DNA fragmendid vastavalt nende suurusele, st väiksemad molekulid liiguvad kiiremini ja jõuavad kaugemale kui suuremad. Pärast geel eletroforeesi kasutamist saab dna fragmente: PCR-iga paljundamine, kloneerimine vektoritesse, geeni-raamatukogus säilitamine, mikrokiibi analüüs, järjestamine ehk sekveneerimine 22. Mis on Southern, Western, Northern, Eastern Blot ja Dotplot?
elektrivälja rakendamisel katoodilt anoodile, agroosis peatuvad pikemad molekulid lähemal alguskohale (hambale). Lisaks molekulide erinevale suurusele mõjutab nende liikumist ka konformatsioon – tsirkulaarsed molekulid liiguvad kas aeglasemalt või kiiremini kui sama pikad lineaarsed molekulid. Tiheduselt sarnane vedelikele kuid füüsikalised omadused sarnanevad tahketele ainetele. Geel ujub vedeliku sees. Vannis on 2 elektroodi (+ ja -) Geeli otsas on kamm mis teeb geeli (agaroosi) sisse augud. Osakesed hakkvad agaroosis erinevatel kiirustel liikuma. Milleks tuleb valkude geel-elektroforeesil kasutada naatrium-dodetsüülsulfaati (SDS)? Sest agroosgeelis saab valke eraldada vaid laengu järgi, sest geeli poorid on valkude suuruse järgi eristamiseks liiga suured. Mass-spektromeetria. Valgu segude analüüsiks, toimub vaakumis, võimeline separeerima suuri molekule. 1. proov sisestatakse massispektromeetria aparatuuri ja aurustatakse; 2
lühemate järjestuste puhul piisaks ka 1 minutist). Korduste arv sõltub sellest, kui palju on vaja DNA-d saada, samas liiga palju tsükleid suurendab vigade tõenäosust. c) Geelipildilt on näha, et PCR on tõenäoliselt ebaõnnestunud, kuna bändi pole näha (peaks olema noolega märgitud kohas). Põhjuseks võib olla ebatäpsus. Edasiseks tööks sain L-Envo pEGFP-C2. 2. PCR-i produkti puhastamine a) Kaalusime 1,5g agaroosi, viisime mahu TAE puhvriga 100ml-ni ja kuumutasime segu mikrolaineahjus, kuni agaroos täielikult lahustus. Seejärel jahutasime lahust ringjate liigutustega loksutades. Jahtunud segule lisasime 0,5l EtBr, loksutasime ning valasime lahuse geelialusele. Lasime geelil tarduda. b) Kuna produktide pikkus varieerus 300-2000 bp vahel, siis valmistasime 1,5% agaroos geeli. Mida pikemad produktid, seda lahjem peab olema geel, ning vastupidi. c)
aktiivsus puudub? gusA geen on defektne. 16. Miks peab PCR-il kasutama kahte praimerit? DNA-l on kaks ahelat. 17. Miks peab PCR-il kasutama termostabiilset DNA polümeraasi? DNA denatureeritakse 94-98 kraadi juures. Tavaline polümeraas denatureerub. 18. Miks valmistatakse elektroforeesi puhul geel puhvris, mitte tavalises vees? pH stabiilsuse tagamiseks, PCR toimub ainult kindlal pH-l. 19. Kuidas eristada DNA-fragmente geelelektroforeesil? Molekulid tuleb geelis nähtavaks tuua. Agaroosi kasutatakse maatriksina. 20. Miks voolutatakse geelelektroforeesil paralleelselt reeglina ka suurusmarkerit? Suurusmarker koosneb kindlaksmääratud suurusega molekulide segust, saab määrata meie proovi molekuli suurust. 21. Millise vea oled teinud, kui elektroforeesi ajal proovide liikumist tähistav marker liigub vales suunas? Klemmid valet pidi. 7. teema 1. Mida mõistetakse bakterite kasvu all? Kasv on mikroobirakkude arvukuse tõus või biomassi juurdekasv ruumalaühikus. 2
Sellega DNA ahela paljundamine toimub ekpotentsiaalselt. 2.2 Praktikum – geeli valmimine Esialgu tuleb valida mille kontsentratsiooniga geeli on vaja valmistada. Kuna mul oli tegu lühe DNA lõiguga (335 bp), valisin PCRi produkti detekteerimiseks 1,5% geeli. Geelistavaks aineks on agaroos, mis on pärit vetikatest. Segasime kokku 100 ml 1x TAE puhvrit ja 1,5 g agaroosi. Kuna agaroos ei lahustu hästi, kuumutame segu mikrolaineahis keemiseni (mitte päris keemiseni, et ei keeks üle!) ja vahepael loksutame ringjate liigutusega kuni kõik agaroos on sulanud ja lahus on homogeenne. Pärast jätame segu jahtuma tasakesi 5
kitsalt spetsiifilistele interaktsioonidele, nagu antigeen-antikeha, ensüüm-substraat või retseptor-ligand vastastoime. Afiinsuskromatograafiat kasutatakse mingi komponendi väljapuhastamiseks segust puhverlahusesse ja kontsentreerimiseks, mingi komponendi 35 sisalduse vähendamiseks segus või ligandide otsimiseks. Statsionaarse faasina kasutatakse tavaliselt geelimaatriksit (enamasti agaroosi), kuhu on kinnitatud ligand, millele seostub spetsiifiliselt mingi uuritava segu komponent. Kõige laialdasemalt kasutatakse kahte afiinsuskromatograafia liiki: · immuunoafiinsuskromatograafiat, · metallkelaat-afiinsuskromatograafiat. Immuunoafiinsuskromatograafia puhul on statsionaarseks faasiks kandjale seotud antigeen, mida kasutatakse antikehade eraldamiseks, näiteks, vereseerumist. Metallkelaat-afiinsuskromatograafia ehk immobiliseeritud metalliiooni afiinsuskromato-
annaabi.ee 
