värvainega pannakse süvendi põhja-> DNA on negat. Laenguga ja elektri väljas liigub pluss laengu suunas->DNA on värvitu, selle nägemiseks lisatakse sageli etiidiumbromiidi, mis seostub igasuguse DNA-ga->väikesed DNA jupid liiguvad kiiremini kui suured jupid->DNA jupi pikkuse hindamiseks, lisatakse ühte hambasse redel e. kindla pikkusega DNA lõikudest koosnev kontrollsegu 22. Kas DNA on sinist värvi?-EI, värvusetu 23. Miks hakkab DNA elektroforeesil agaroosgeelis liikuma?- elektrivälja mõjul 24. Millise laenguga on DNA?- negatiivse 25. Kas agaroosgeelis liiguvad kiiremini pikad või lühikesed DNA jupid?- lühikesed 26. Milleks lisatakse agaroosgeelile etiidiumbromiidi?- DNA-le värvuse andmiseks 27. Mida teevad restriktaasid?- lõikavad DNA kindla koha pealt lõikudeks, nii, et tekivad üheahelalised otsad "kleepuvad otsad" 28. Milliseid ettevaatusabinõusid kasutab molekulaarbioloogia labor, et vältida valepositiivseid tulemusi?-
kui geel on tehtud vette, siis Tris puhver tõmbab geelist vee välja. Tagab stabiilse pH. Oluline, sest DNA/RNA laeng sõltub keskkonna pH-st. 13, Miks kasutatakse laadimispuhvrit ja mis on see tavaliselt? DNA proovide kandmisks geelile kasutatakse laadimispuhvrit, mis sisaldab glütserooli. Proov vajub kaevukese põhja. 13. Miks sisaldab puhver ka etiidiumbromiidi? Selleks, et hiljem visualiseerida DNA froees UV-valguses (254 nm). 14. Mis suunas liiguvad geelis molekulid? Liiguvad agaroosgeelis elektrivälja rakendamisel katoodilt anoodile (+). 15. Kui sul on kaks E.colit, mida teed, et teada saada kas RecA on olemas? 1) PCR 2) UV-ga kiiritad UV-ga kiiritad. Kui RecA on olemas, siis aktiveerib see RecA proteolüütilist stimuleeriva fn-i. RecA aktiveerib LexA autokatalüütilise proteolüüsi ja LexA vabastab enda kontrolli alt olevad SOS reparatsioonigeenid. LexA on repressor ja tavaolukorras on tema kontrolli all olevate geenid ekspressioon takistatud (Uvr).
Kui oleks vaja valada 0,75% geel 80ml TAE puhvrist, mitu g agaroosi oleks tarvis võtta? Kui palju tuleks lisada EtBr kui alg- ja lõppkontsentratsioon on samad praktikumis kasutatutega? Lahusti: 80 ml Agaroosi on vaja: 80 x 0,75/100 = 0,6g EtBr algkontsentratsioon : 10mg/ml=10µg/µl EtBr lõppkontsentratsioon: 0,05µg/ml Saame teada, mitu µg meil on EtBr vaja: 80 x 0,05 = 4µg Mitu µl on EtBr vaja? 10/4 = 1/x ehk x = 4/10 = 0,4µl Praktiline töö nr. 3: DNA lahutamine agaroosgeelis Eesmärk: PCR produkti lahutamine geelelektroforeetiliselt. Materjalid: 18 µl PCR produkt DNA, mida visualiseerima 3,6 µl DNA laadimispuhver DNA visualiseerimiseks ja paremini hambasse vajutamiseks. TAE agaroosgeel GeneRuler 100bp Plus Marker DNA fragmentide pikkuse ning Ladder koguae ligikaudseks kvantifitseerimiseks Arvutused:
Selliseid DNA molekule, mis on eeltoodud moel moodustatud nimetataksegi rekombinant- DNA molekulideks, millest ka nimi kogu tehnoloogiale. Lisaks eeltoodule saab restriktaasi abil lohustatud DNA molekuli uurida elektroforeetiliselt. Nimelt moodustub restriktaasi toimel DNA molekulist erineva pikkusega fragmente (restriktsiooni fragmendid), millel on ka erinev molekulmass. DNA lohustub nii mitmeks fragmendiks kui mitu vastavat loikepiirkonda temas on. Elektroforeesil agaroosgeelis liiguvad need fragmendid erineva kiirusega asetudes ritta vastavalt molekulmassile. Need fragmendid varvitakse voi margistatakse radioaktiivsete isotoopidega ning maaratakse nende molekulmass. Sel teel saame DNA restriktsioonikaardi e profiili. Selle alusel on voimalik vorrelda erinevate isendite geneetilisi koode ilma NH jarjestust maaramata. Samuti saab maarata naiteks erinevate mikroobituvede geneetilist sugulust, mistottu see on ka molekulaarepidemioloogia uks olulisi meetodeid.
ribosoome, proteiine ja viirusi, samuti uurida rakumembraani kihte. Saab nt. kindlaks teha missugustest aminohapetest koosneb valk jne. Molekulid kas lahustuvad tsentrifuugi käigus, vajuvad põhja või moodustuvad kihid. Geel-elektroforees on elektroforeesi rakendus, mida kasutatakse erinevate elektriliselt laetud molekulide (DNA, RNA, valgud) eraldamiseks pikkuse, laengu või konformatsiooni järgi agaroosist. Negatiivselt laetud nukleiinhapete (DNA, RNA) molekulid liiguvad agaroosgeelis elektrivälja rakendamisel katoodilt anoodile, agroosis peatuvad pikemad molekulid lähemal alguskohale (hambale). Lisaks molekulide erinevale suurusele mõjutab nende liikumist ka konformatsioon – tsirkulaarsed molekulid liiguvad kas aeglasemalt või kiiremini kui sama pikad lineaarsed molekulid. Tiheduselt sarnane vedelikele kuid füüsikalised omadused sarnanevad tahketele ainetele. Geel ujub vedeliku sees. Vannis on 2 elektroodi (+ ja -) Geeli otsas on kamm
talitluslikku aktiivsust määrates nende poolt produtseeritava informatsiooni RNA hulka tsütoplasmas, aga ka näiteks viirusliku RNA vôi DNA olemasolu ja lokalisatsiooni kudedes ning rakkudes. NH hübridiseerimise eri juhuks on ka sellised meetodid nagu Southern blotting ja Northern blotting ("lõuna" ja "pôhja" märgistamine). E.M. Southern töötas välja meetodi DNA fragmentide kindlakstegemiseks agaroosgeelis. Restrikataasi abil lôhustatud kaksikahelalise DNA fragmentide elektroforeetilise lahutamise järel denatureeritakse DNA topeltahelad üksikahelateks NaOH abil. Denatureeritud ahelad kantakse üle nitrotselluloos kilele. Kile viiakse sondi sisaldavasse lahusesse. Sond hübridiseerub vastava üksikahelise DNA fragmendiga ja tema asukoht elektroforegrammil on vôimalik kindlaks määrata, kuna sond on märgistatud. Northern blotting'iks nimetatakse RNA fragmentide määramist samal meetodil. 49
defektgeenide olemasolu, geenide talitluslikku aktiivsust määrates nende poolt produtseeritava informatsiooni RNA hulka tsütoplasmas, aga ka näiteks viirusliku RNA vôi DNA olemasolu ja lokalisatsiooni kudedes ning rakkudes. NH hübridiseerimise eri juhuks on ka sellised meetodid nagu Southern blotting ja Northern blotting ("lõuna" ja "pôhja" märgistamine). E.M. Southern töötas välja meetodi DNA fragmentide kindlakstegemiseks agaroosgeelis. Restrikataasi abil lôhustatud kaksikahelalise DNA fragmentide elektroforeetilise lahutamise järel denatureeritakse DNA topeltahelad üksikahelateks NaOH abil. Denatureeritud ahelad kantakse üle nitrotselluloos kilele. Kile viiakse sondi sisaldavasse lahusesse. Sond hübridiseerub vastava üksikahelise DNA fragmendiga ja tema asukoht elektroforegrammil on vôimalik kindlaks määrata, kuna sond on märgistatud. Northern blotting'iks nimetatakse RNA fragmentide määramist samal meetodil.
2. 95 °C 10 sekundit – DNA ahelate denatureerimine 3. 56 °C 20 sekundit – praimerite seondumine DNAle (annealing) 4. 72 °C 3 minutit – DNA süntees 5. Kordamine alates 2. punktist 21 korda 22. Selline sünteesiaeg valitakse sõltuvalt polümeraasist. HotFIRE Pol sünteesib keskmiselt 1 kb DNAd 1 minuti jooksul ning selline aeg valitakse nii, et kõik järjestused jõudsid paljuneda ( näiteks meil oli kõige pikem produkt – 2400 aluspaari). 23.DNA lahutamine agaroosgeelis 24. Eesmärgiks on visualiseerida oma produkti ning hinnata selle suurust. DNA lahutamisel kasutatakse agaroosi (disahhariid, koosneb D-galaktoosist ja 3,6-anhüdro-L-galaktoosist). 1. päev: kasutatava agaroosgeeli kangust arvutatakse võttes arvesse oodatava produkti pikkust. Meie kasutasime 1% geeli. Segasime kokku 100 ml TAE puhvrit, 1 gr agaroosi ning kuumutasime mikholaineahjus sulamiseni. Jahtunud geelisegule lisasime1 μl EtBr, mida kasutatakse DNA visualiseerimiseks
67 nukleotiidi. See on restriktsioonikoht, kus toimub DNA ahela lõikamine. Tekkivate lõikude pikkus ja arv sõltub eeskätt lõigatava DNA pikkusest ja ensüümi tüübist. Näiteks ribotüpeerimise korral teostatakse bakteri kromosomaalse DNA restriktsioon, millele järgneb elektroforees ja Southern’ hübridisatsioon. Hübridisatsiooniks kasutatakse sonde, mis seostuvad ribosoome kodeerivate geenidega. Restriktsioonile järgneb elektroforees agaroosgeelis, mis võimaldab tekkinud DNA fragmentide eraldamise nende suurusest lähtudes. PFGE – PULSED FIELD GEL ELECTROPHORESIS. Pulss-välja geelelektroforees on molekulaarsete tüpiseerimismeetodite standardiks. Terviklikest bakterirakkudest valmistakse nn. agarpunnid. Seejärel tehakse bakteri DNA-le restriktsioon. Elektroforees toimub pulseeriva elektrivälja tingimustes. PFGE võimaldab lahutada väga suure molekulmassiga DNA fragmente vahemikus 10 kb kuni 800 kb.
geenide talitluslikku aktiivsust määrates nende poolt produtseeritava informatsiooni RNA hulka tsütoplasmas, aga ka näiteks viirusliku RNA vôi DNA olemasolu ja lokalisatsiooni kudedes ning rakkudes. NH hübridiseerimise eri juhuks on ka sellised meetodid nagu Southern blotting ja Northern blotting ("lõuna" ja "pôhja" märgistamine). E.M. Southern töötas välja meetodi DNA fragmentide kindlakstegemiseks agaroosgeelis. Restrikataasi abil lôhustatud kaksikahelalise DNA fragmentide elektroforeetilise lahutamise järel denatureeritakse DNA topeltahelad üksikahelateks NaOH abil. Denatureeritud ahelad kantakse üle nitrotselluloos kilele. Kile viiakse sondi sisaldavasse lahusesse. Sond hübridiseerub vastava üksikahelise DNA fragmendiga ja tema asukoht elektroforegrammil on vôimalik kindlaks määrata, kuna sond on märgistatud. Northern blotting'iks nimetatakse RNA fragmentide määramist samal meetodil. 42
olemasolu, geenide talitluslikku aktiivsust määrates nende poolt produtseeritava informatsiooni RNA hulka tsütoplasmas, aga ka näiteks viirusliku RNA vôi DNA olemasolu ja lokalisatsiooni kudedes ning rakkudes. NH hübridiseerimise eri juhuks on ka sellised meetodid nagu Southern blotting ja Northern blotting ("lõuna" ja "pôhja" märgistamine). E.M. Southern töötas välja meetodi DNA fragmentide kindlakstegemiseks agaroosgeelis. Restrikataasi abil lôhustatud kaksikahelalise DNA fragmentide elektroforeetilise lahutamise järel denatureeritakse DNA topeltahelad üksikahelateks NaOH abil. Denatureeritud ahelad kantakse üle nitrotselluloos kilele. Kile viiakse sondi sisaldavasse lahusesse. Sond hübridiseerub vastava üksikahelise DNA fragmendiga ja tema asukoht elektroforegrammil on vôimalik kindlaks määrata, kuna sond on märgistatud.
geenide talitluslikku aktiivsust määrates nende poolt produtseeritava informatsiooni RNA hulka tsütoplasmas, aga ka näiteks viirusliku RNA vôi DNA olemasolu ja lokalisatsiooni kudedes ning rakkudes. NH hübridiseerimise eri juhuks on ka sellised meetodid nagu Southern blotting ja Northern blotting ("lõuna" ja "pôhja" märgistamine). E.M. Southern töötas välja meetodi DNA fragmentide kindlakstegemiseks agaroosgeelis. Restrikataasi abil lôhustatud kaksikahelalise DNA fragmentide elektroforeetilise lahutamise järel denatureeritakse DNA topeltahelad üksikahelateks NaOH abil. Denatureeritud ahelad kantakse üle nitrotselluloos kilele. Kile viiakse sondi sisaldavasse lahusesse. Sond hübridiseerub vastava üksikahelise DNA fragmendiga ja tema asukoht elektroforegrammil on vôimalik kindlaks määrata, kuna sond on märgistatud. Northern blotting'iks nimetatakse RNA fragmentide määramist samal meetodil. 42
Selliseid DNA molekule, mis on eeltoodud moel moodustatud nimetataksegi rekombinant-DNA molekulideks, millest ka nimi kogu tehnoloogiale. Lisaks eeltoodule saab restriktaasi abil lõhustatud DNA molekuli uurida elektroforeetiliselt. Nimelt moodustub restriktaasi toimel DNA molekulist erineva pikkusega fragmente (restriktsiooni fragmendid), millel on ka erinev molekulmass. DNA lõhustub nii mitmeks fragmendiks kui mitu vastavat lõikepiirkonda temas on. Elektroforeesil agaroosgeelis liiguvad need fragmendid erineva kiirusega asetudes ritta vastavalt molekulmassile. Need fragmendid värvitakse või märgistatakse radioaktiivsete isotoopidega ning määratakse nende molekul- mass. Sel teel saame DNA restriktsioonikaardi e profiili. Selle alusel on võimalik võrrelda erinevate isendite geneetilisi koode ilma NH järjestust määramata. Samuti saab määrata nt erinevate mikroobitüvede geneetilist sugulust. Rekombinant DNA ja DNA kloonimine
annaabi.ee 
