Valgu kontsentratsiooni määramine Bradfordi meetodil - Praktika Labori töö | Kategooriata - Genoomika ja proteoomika

22

doc

Molekulaar- ja rakubioloogia

Kuna vektori ja inserdi pikkuste suhe 3851/330=11,7. Kuna vektorit oli 9 ng, saame leida vektori ja inserdi koguste suhte: (13,7*11,7)/9=17,70. See suhe on küllaltki sobiv. 3. Rekombinantse plasmiidi ligeerimine a) Kasutasime pSTBlue-1 vektorit, mis sisaldab kahte replikatsiooniks vajalikku origini (üks kummaski suunas), ampitsilliini ja kanamütsiini resistentsusgeeni ja lacZ operoni, mille lugemisraami sisestame oma inserdi. See võimaldab sini-valge meetodil välja selgitada, millistes kolooniates on tühi, millistes meie inserti sisaldav plasmiid. Vektoril on T-overhangidega otsad, mis võimaldab A-overhangidega inserti sisestada. b) PCR-i produkti on võimalik vektorisse ligeerida, kuna vektoril on T-overhang otsad ning PCR-i produktil on A-overhang otsad. T ja A on omavahel komplementaarsed, seega vektori ja inserdi ,,kleepuvad otsad" ühendatakse komplementaarsusprintsiibi

Molekulaar- ja rakubioloogia praktikum

20

docx

Spektrofotomeetria protokoll

YKA3411 Instrumentaalanalüüs SFM Spektrofotomeetria Õpperühm: Töö teostaja: Õppejõud: Töö teostatud: 30.03.15 1 Teoreetilised alused Keemias on spektrofotomeetria füüsikalis-keemiline ainete uurimise meetod, mis tegeleb ainete neeldumisspektritega ultraviolett-, nähtava valguse ja infrapunakiirguse piirkonnas. Spektrofotomeetria on kiirguse (valguse) intensiivsuse ja lainepikkuse sõltuvuse kvantitatiivne määramine olenevalt uuritava aine omadustest ja aine hulgast. Selleks kasutatakse spektrofotomeetrit. See on aparaat, mis registreerib kiirguse intensiivsuse (riista näidu) sõltuvalt lainepikkusest, seega saadakse aine spekter kiirguse teatud lainepikkuste vahemikus. Spektrofotomeetria võimaldab ainete määramist valguse absorptsiooni või hajumise intensiivsuse muutusest erinevatel lainepikkustel. Üldiselt on need meetodid kasutatavad nii kvalitatiivseks kui ka kvantitatiivseks ainete määramiseks

Keeled

10

docx

SFM-protokoll Spektrofotomeetria

YKA3411 Instrumentaalanalüüs SFM Spektrofotomeetria Õpperühm: Töö teostaja: Õppejõud: Töö teostatud: 30.03.15 1 Teoreetilised alused Keemias on spektrofotomeetria füüsikalis-keemiline ainete uurimise meetod, mis tegeleb ainete neeldumisspektritega ultraviolett-, nähtava valguse ja infrapunakiirguse piirkonnas. Spektrofotomeetria on kiirguse (valguse) intensiivsuse ja lainepikkuse sõltuvuse kvantitatiivne määramine olenevalt uuritava aine omadustest ja aine hulgast. Selleks kasutatakse spektrofotomeetrit. See on aparaat, mis registreerib kiirguse intensiivsuse (riista näidu) sõltuvalt lainepikkusest, seega saadakse aine spekter kiirguse teatud lainepikkuste vahemikus. Spektrofotomeetria võimaldab ainete määramist valguse absorptsiooni või hajumise intensiivsuse muutusest erinevatel lainepikkustel. Üldiselt on need meetodid kasutatavad nii kvalitatiivseks kui ka kvantitatiivseks ainete määramiseks

Instrumentaalanalüüs

11

docx

Spektrofotomeetria

Kui valgusvoog intensiivsusega I0 läbib lahusega täidetud küveti, on küvetist väljuva valgusvoo intensiivsus I neeldumise ja osalise peegeldumise tõttu väiksem. Lambrt- Beeri seaduse järgi: I0- lahusele langeva valguse intensiivsus I- lahust läbinud valguse intensiivsus -aine molaarne neeldumistegur, mis sõltub lahuse kontsentratsioonist, temperatuurist, valguse lainepikkusest, valguse neelava aine iseloomust (M-1cm-1) l- lahusekihi paksus (cm) C- lahustunud aine molaarne kontsentratsiooni (M) =-logT=-log(I/I0) A-lahuse neelduvus (optiline tihedus) T- läbilaskvus Elektromagneetiline kiirgus ehk valgus on dualistliku olemusega: 1.Seda saab vaadelda valgusosakesena ehk footonina ehk valguskvandina, mida iseloomustab energia E=h*v (h=6,6254*10^-34 J/s) 2.Samas võib valgust käsitleda elektromagnetlainena. Igal ainel on omadus neelata ja peegeldada elektronmagnetkiirgust, kusjuures neeldunud ja peegeldunud hulk on võrdeline aine hulgaga

Instrumentaalanalüüs

50

docx

Molekulaar- ja rakubioloogia

inserdi, aga valged sisaldasid õige plasmiidi. Valisin kõige suurema valge koloonia ja panin neid kasvama:  Võtsin epsi, kus tegin augu (ilma hapnikuta bakretid suervad ära)  Lisasin 1ml Amp-i sisalav vedelsööde  Otsikuga katsusin valge kolooniat ja panin otsik epsi sisse  Panin bakterid loksutavasse inkubaatorisse 16 tunniks kasvama 375 C juures 6.1 Praktikum – minipreparatsioon aluselise lüüsi meetodil Eesmärgiks on bakteris paljundatud plasmiidi välja puhastamine.  Võtsin üleöö kasvanud bakterid ja fuugisin bakterid põhja  Eemaldasin supernatanti  Re-suspendeerisin pellet 0,2 ml-s E1 lahuses (50mM glükoos – teeb lahuse isotooniliseks, 25 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10nM EDTA-Na2 – seob katioone, inhibeerides ensüüme(DNAaasid) ja destabiliseerib raku membraani, RnaasA 10 µl/ml

Molekulaar- ja rakubioloogia praktikum

97

pdf

Biokeemia praktikumi juhend

.................................................................................. 30 2. SEGUDE LAHUTAMINE JA AINETE IDENTIFITSEERIMINE ................................... 32 2. A Kromatograafilised meetodid........................................................................... 32 2.B Spektroskoopilised meetodid ........................................................................... 38 2 2.1 AINETE SEGU LAHUTAMINE GEELKROMATOGRAAFIA MEETODIL .......... 46 Teooria ................................................................................................................ 46 Töö käik .............................................................................................................. 51 Kontrollküsimused ............................................................................................... 57 2.2 KAROTENOIDIDE IDENTIFITSEERIMINE JA SISALDUSE MÄÄRAMINE ..... 58 Teooria .......

Biokeemia

30

doc

Biokeemia praktikumi K.T vastused

indikaatorina, omandades leeliselises keskkonnas oranzi värvuse. Milloni reaktsioon: Milloni reaktiiv -elavhõbe(II)nitraadi lahust lämmastikhappes vähese NaNO2 lisandiga. Milloni reaktiiviga reageerivad fenoolset hüdroksüülrühma sisaldavad ühendid, seega valkude puhul türosiini (Tyr) radikaalid. Kuna türosiin esineb enamiku valkude koostises, siis suurem osa valkudest annab positiivse Milloni reaktsiooni, mille puhul valgu lahus või denatureerunud valgu sade värvuvad soojendamisel roosakaks kuni tume(telliskivi)- punaseks. 3 7. Mis on valgu isoelektriline punkt (pI)? Valgu pI näitab keskkonna pH väärtust, mille juures valgumolekulis on positiivsete ja negatiivsete laengute hulk võrdne, seega molekuli summaarne laeng võrdub 0-ga. Sellest tingituna valgumolekulid agregeeruvad hõlpsasti ning sadestuvad lahusest välja.

Biokeemia

36

docx

Molekulaarbioloogia aruanne

8. Enne järgmist praktikumi tuleb panna saadud valged kolooniad kasvama. Selleks kasutasin eppendorfi, mille korgi sisse torkasin õhuaugu. Valasin 1 ml vedelsöödet (840 μl LB söödet), mis sisaldab 160 μl Amp-i (algne konts. 100 mg/ml) ning pipeti otsiku abil lisasin baktereid minu kolooniast (ühest, tähistasin seda Peetri tassil). Asetasin tuubid kasvama 37 °C inkubaatorisse. 53. 54. Minipreparatsioon aluselise lüüsi meetodil 55. Eesmärgiks on bakteris paljundatud plasmiidi välja puhastamine. Selleks kasutatakse erinevaid lahuseid, mis muutuvad pH-d ja mille lisamise tagajärjel paljud fragmendid, mis saastavad plasmiidse DNA, tekitavad sadet ning neid on lihtne eraldada. 56. Aluselise lüüsi meetodil on tähtis see, et pH muutmisel bakteri genoomne DNA denatureerub kuid plasmiidse DNA ahelad jäävad seotuna teineteisega. Kui muuta pH esialgseks väärtuseks,

Molekulaar- ja rakubioloogia praktikum