• Lokaalsed nahainfektsioonid (võib kahjustada kõiki naha kihte): impetiigo (epidermise kahjustus), follikuliit, furunkel (karvafolliikli põletik koos ümbritseva koe kahjustusega), karbunklid (mitmed karvafolliiklid + subkutaanne kude), haavainfektsioonid, hidradeniit (higinäärmete kahjustus), mastiit. • Bakterieemia, endokardiit. • Pneumoonia, empüeem. Hematogeenne pneumoonia endokardiidile kaasuvana; KOKi, tsüstilise fibroosi pt-del aspiratsioonipneumoonia sage tekitaja, esineb ka imikutel. • Osteomüeliidile eelneb trauma/nahainf. Sümptomid: valu, palavik, 50% (+) verekülv, abstsess. Septilise artriidi sagedasem tekitaja lastel (täiskasvanutel gonokokk). diagnostika. • Uuritav materjal: nahainf-d – nahk, (veri); pneumoonia – röga, veri; endokardiit – veri; artriit – liigesevedelik, seerum, (veri); osteomüeliit – luubiopsia, (seerum); naha eksfoliatiivne sündroom – neelulima, (nahk), (veri);
Valmistavad raskusi steriliseerimisel, sest väga resistentsed kemikaalidele, temperatuurile. § Eosed ei ole mitte paljunemiseks, vaid aitavad säi-luda ebasoodsates keskkonnatingimustes. Haigustekitajatest esinevad Bacillus spp. ja Clostridium spp. § Eosed ei sisalda peaaegu üldse vett, metaboolne aktiivsus puudub, sisaldavad Ca++ ja dipikoliinhapet. § Muutumine vegetatiivseteks vormideks toimub minutite jooksul. Bakterite kasv § Bakterite paljunemine üks bakter jaguneb kaheks. § Bakterite arv populatsioonis suureneb geomeetrilises progressioonis Nt=N0 × 2n § Generatsiooniaeg () on aeg, mis kulub bakterite arvu kahekordistumiseks. § Optimaalsetes tingimustes 20-60 minutit § Organismis enamusel patogeenidel 5- 10 tundi Temperatuuri toime bakterite kasvule Kõrgem temperatuur kiirendab keemilisi reaktsioone - kiiruse kasv ca 2 korda 10°C kohta. Liiga kõrge tem- peratuur denatureerib valgud, metabolism häirub, kasv peatub, bakterid hukkuvad
Nakkushaiguste diagnostika kordamisküsimused II: võrdlus, immunoloogia, molekulaardiagnosika 1. Millised on nõuded proovi võtmisel nakkushaiguste diagnostikaks?- proovi tuleb võtta aseptiliselt tekitaja kohast enne antib.ravi algust 2. Nimeta mikrobioloogilise külvimeetodi etapid.- esmakülv, puhaskultuuri isoleerimine, mikroobi identifitseerimine ja antibiogramm 3. Miks on uriini mikrobioloogilise külvimeetodi puhul (semi)kvalitatiivne tulemus oluline. saab määrata mikroobide kogust ja hulka arvuliselt (+/- ) 4. Kumb meetod on referentmeetodiks bakterite puhul, keda on lihtne mikrobioloogiliselt kasvatada: molekulaarne meetod või mikrobioloogiline külv?- mikrobiol.külv 5
7. Tuberkuloosi patogenees · Nakatumine toimub enamasti piisknakkusena. · Esmase tuberkuloosi korral tuberkuloositekitajad levivad lümfo või hematogeensel teel organitesse: kops, lümfisõlmed. · Tuberkuloositekitajad on organismis rakusisesed parasiidid. Haiguse algstaadiumis paljunevad nad makrofaagides (mittetäielik fagotsütoos). · Tervetel inimestel tekib vastusena IV tüüpi allergiline reaktsioon ja rakuline immuunvastus. Hilistüüpi ülitundlikkuse reaktsiooni tõttu infitseeritud makrofaagid hävitatakse, teine osa aga transformeerub epitelioidseteks rakkudeks ja hiidrakkudeks, hiljem tekib tuberkul. · Pärast esmase tuberkuloosi põdemist ja paranemist võib haigestuda teisesesse tuberkuloosi. Sel juhul on tegemist: uue nakatumisega või esmase tuberkuloosi vanade kollete aktiveerumisega. · Teisese tuberkuloosi kulg on reeglina raskem. 8
Valgusmikroskoobid on odavad. Puudused: eeldab väga hea mikroskoopia kogemust; pole väga tundlik meetod; sõltub transpordist; 2. isoleerimine/kultuurimeetod plussiks on spetsiifilisus. Miinused: mikroob ei tohi transpordi käigus enne kultuuri panemist ära surra; võib siiski osutuda mittespetsiifiliseks (söötmetest sõltuv); aeganõudev (tuberkuloosibakter kasvab 1,5 2 kuud); nõuab samastamist (kasvatame üles, peame veel kinnitama, et on see bakter DNA hübridisatsiooniga); inimest on juba ravima hakatud ja alles siis võetakse proov kasv on pärsitud juba; saastamine transpordil. 3. Biotestid 1. rakukultuur kliiniline proov, millega neid rakke nakatame. Kõige tuntum on klamüüdia diagnostika. Rakukultuuris kasvatatud organism ei tohi olla transpordil või ravi tõttu surnud. 2. Loomkatsed katkupisiku diagnostika. Eetikaküsimus. Loomad on väga kallid.
Ikosaeedriline kapsiid, diameeter 50…55 nm, kaks struktuurset valku moodustavad 72 kapsomeeri. Kodeerib valke, mis soodustavad rakukasvu, see omakorda võimalda lüütilist viirusreplikatsiooni. Väike, ümbriseta, ikosaeedriline. Kaheahealaline rõngas-DNA. Genoomi iseloomustus replikatsiooni all. Epidemioloogia. HPV on inaktivatsioonile resistentne, persisteerib elututel objektidel nagu mööbel, vannitoa põrand, rätikud. Infektsioon saadakse otsesel kontaktil väikeste naha- või limaskestalõhede kaudu, suguvahekorra ajal, sünnitusteede läbimisel. Tavalised, plantaarsed või lamedad tüükad on kõige sagedasemad lastel, noortel täiskasvanutel. Kõripapülloomid tekivad noortel lastel ja keskealistel. Võimalik, et on kõige laiemalt levinud STD maailmas. 99,7% emakakaelavähkidest on HPV olemas. HPV-16, -18, -31 ja -45 on kõrge riskiga, -6 ja -11 madala riskiga emakakaelavähi suhtes
Erinevate „lahtrite” koerakud ekspresseerivad vastavaid adhesioonimolekulide ligande ja toodavad vastavaid kemokiine. Lokaalsetes „lahtrites” kontrollivad lümfotsüütide liikumisi koespetsiifilise adhesiooni ja kemokiinide mõjud. Sekretoorne IgA: Kuigi osa IgA (teda on umbes 3 g/l s.h. IgA1 80% ja IgA2 80%) antikehadest tehakse süsteemses immuunsüsteemis (see tähendab, et osaliselt luuüdis), valmib enamik siiski plasmarakkude poolt toodetuna lamina proprias. See antikeha transporditakse üle epiteliaalsete rakkude trakti luumenisse ehk valendikku spetialiseerunud mehhanismi abil: IgA subepiteliaalses lamina proprias seondub IgA polü-Ig retseptoritega ja transporditakse endosoomide kaudu luumeni ehk valendiku pinnale. Mitte vähem kui 3g transporditakse päevas gastrointestinaaltrakti, millest 1/3 läheb maksa ja sapi kaudu. See kaitseb mukoosseid pindu mikrobiaalse invasiooni eest. Sekretoorset IgAd leidub pisarates,
Kordamisküsimused (Jõers) 1.Millised on PCR-diagnostikalabori organisatsiooni põhiprintsiibid? Puhas ruum · Puhtas ruumis hoitakse reaktsioonilahuseid · Segatakse kokku reaktsioonisegu nn. mastermix · Puhtas ruumis oma kittel, pipetid, räkid nendega ei tohi liikuda teistesse ruumidesse Mida tehakse patogeeniruumis? · DNA eraldamine proovimaterjalist (seerum, uriin jne) · Rakud lüüsitakse, DNA vabastatakse teda pakkivatest valkudest · Edasi liigub juba mittepatogeenne materjal ehk puhastatud DNA · Siin oht nakatada iseennast ja keskkonda! Segamiseruum · Segatakse kokku patogeeniruumist tulnud DNA ja puhtas ruumis kokku segatud mastermix Siin enam nakkusohtu ei ole, kuid kantakse kummikindaid oht kontamineerida testitav materjal Siin tavalisi desinfektsioonilahuseid kasutada ei saa, pindade puhastamine DNAd lõhkuvate ainetega (kloor!) Siin asub arhiiv proovimaterjalist eraldatud DNA säilitatakse 1 aasta laborikoodide alusel Masinaruum Masinaruumis toimub
DNA viirused Herpesviridae – ümbrisega Herpesviridae -> Alamsugukond – Alphaherpesvirinae -> Perekond - Mareki haiguse tekitaja laadsed viirused Tüüpliik - lindude herpesviirus-2 -> Liigid – lindude herpesviirus-2 (Mareki haiguse viirus-1), lindude herpesviirus-3 (Mareki haiguse viirus-2) -> Mareki haigus Viirus põhjustab kodulindudel lümfomatoosi, neuropaatiat. Viirusel eristatakse kolm serotüüpi: 1. väga virulentne onkogeenseid muutusi põhjustav tüvi, 2. kalkunitelt ja kanatibudelt kaks mitteonkogeenset tüve. Viirus-rakk interaktsioonid: produktiivne
geneetilisest materjalist ühte konkreetset alamosa. 17. Kirjelda polümeraasi ahelreaktsiooni läbiviimist detailselt (komponendid, temperatuurid, aparatuur, metoodika, eesmärk, tüübid). 2:6-10. Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR) on on tänapäeva molekulaarbioloogide üks põhilisi meetodeid, mis võimaldab sünteesida suurt hulka identseid DNA molekule in vitro. PCR metoodika väljatöötamine sai võimalikuks, kui avastati kuumaveeallika bakter, kes suurepäraselt elab ja paljuneb üle 70-kraadises vees. Tema DNA-polümeraasi kasutatakse PCR- meetodis, mis võimaldab in vitro paljundada ehk amplifitseerida konkreetset, uuritavat DNA fragmenti. See meetod on loodud ülilihtsal põhimõttel: temperatuuride muutmisel. Selleks on PCR-masin, millesse asetatakse 0,2 ml-sed tuubid DNA-proovidega ja käivitatakse programm, mis automaatselt kuumutab-jahutab kindlal temperatuuril kindlate ajavahemike järel.
Kuulutab välja WHO Endeemia- looduslikest/sanitaarsetest tingimustest põhjustatud, mingi nakkushaiguse pikaajaline esinemine ühes teatud piirkonnas( Eesti-puukentsefaliit) Gripile on iseloomulik- üldintoksikatsiooninähud, kõrge palavik, väga halb enesetunne Viirus Gripp-influenza Paragripp- parainfluenza Adenoviirus- RS infektsioon (respiratoor ne Süntsütsiaal ne e. pneumo viirusinfektsi
konservatiivsus Prokarüoodid paljunevad klonaalselt, seetõttu nn puhas vertikaalne ülekanne HORISONTAALNE – geneetiliselt sõltumatute isendite vahel Ebapüsiv, liikuv, uudne ja võib toimuda prokarüoodilt prokarüoodile, prokarüoodilt eukarüoodile kui ka eukarüoodilt prokarüoodile Horisontaalses ülekandes on 2 osapoolt: DOONOR ehk DNA VÄLJASTAJA ja RETSIPIENT ehk DNA VASTUVÕTJA. Üleantavat DNA-d nim endogenoodiks. o Doonor – bakter, kes väljastab geneetilist materjali DNA või RNA näol o Retsipient – bakter, kes võtab väljastatud geneetilise materjali vastu 20. Plasmiidse DNA piirkonnad Plasmiid kujutab endast kaheahelalist DNA rõngasmolekuli, mis replitseerub bakteri genoomist sõltumatult. Plasmiidid esinevad peaagu kõigis bakterites, seejuures võib ühes rakus olla mitu erinevat plasmiidi. Plasmiidi DNA koosneb funktsionaalselt 2-3 piirkonnast;
1. Virulentsus, virulentsust mõjutavad tegurid, virulentsuse hindamine Virulentsus on viiruse tõvestusvõime, patogeensuse aste, mis näitab patogeeni võimet tungida peremeeslooma, põhjustada haigusi.Virulentsus on patogeensuse mõõt. Organismi patogeensus ehk võime põhjustada haigust on määratud virulentsusfaktoritega. Hinnatakse katseloomade peal (hiired). Atenueeritud viirus - tõvestamisvõime on nõrgestatud (nt kultuuri lahjendamisega). Kui tõsine haigus tekib, sõltub viiruse nakatamisvõimest ja peremeeslooma resistentsusest. Virulentsust saab hinnata, kui tõsised kahjustused tekkisid, kus tekkisid. Sõltub doosist, viiruse geneetikast, sisenemisest organismi, peremeesorganismi faktoritest. LD50 – letaalne doos – 50% loomadest surevad. nt: 5 virioni, keskmiselt attenueeritud viirus 5000 virioni, kõrgelt attenueeritud viirus 1mln virioni.
(vähesed bakterid hüdrolüüsivad). 15. Miks ei sobi želatiin söötme geelistajana? Veeldub toatemperatuuril (25 kraadi) ja ei ole mikrobioloogiliselt inertne (kes toodavad proteolüütilisi ensüüme, need lagundavad). 16. Miks ei valata agarsöödet välja liiga kuumalt? Liigse kondentsvee tekkimise vältimiseks. 17. Miks hoitakse söötmeplaate pärast söötme tardumist ümberpööratult (põhi ülespoole?) Kondentsvee tekkimise vältimiseks. 18. Miks autoklaavitakse agar ekstreemsete pH-dega söötmete jaoks eraldi? Alla pH 5,5 agar hüdrolüüsub ja ei tardu pärast steriilimist. Vajaliku pH-ga sööde ja vesiagar (steriilitakse dest vesi + agar) segatakse pärast steriilimist kokku. 19. Missugused raku surma esilekutsuvad tegurid mõjuvad raku seinale, plasmamembraanile, valkudele ja nukleiinhapetele? fenool (rakukest, tsütoplasmamembraan, denatureerib valke), alkohol (tsütoplasmamembraan, denatureerib valke, ei hävita endospoore). 20
e) Mikroobirakkude purustamine 19. Milline järgnevatest väidetest Ti plasmiidi kohta on kõige täpsem: a) Ti plasmiid pärineb Agrobacterium tumefaciens-ilt b) Ti plasmiidi on kasutatud taimede insenergeneetikas geenide ülekandeks taime c) Ti plasmiid indutseerib kasvajate teket taimejuurtel d) Ti plasmiid sisaldab opiinide sünteesi ja metabolismi ning ka virulentsusgeene e) Kõik ülaltoodu on õige Kontrolltöö 3. 1. Millist prenataalse diagnostika meetodit on kõige sobivam kasutada loote DNA analüüsiks raseduse 16. nädalal? a) Võrdlev genoomne hübridisatsioon DNA kipidel (array-CGH) b) Amniotsentees c) Koorioni hattude biopsia d) Fluorestsents in situ hübridisatsioon (FISH) 2. Millist järgnevatest süsteemidest saab kasutada eukarüootsesse organismi sisestatud transgeeni ekspressiooni taseme kontrollimisel? a) Rekombinantse TetR promootori süsteemi b) Kõiki siintoodud süsteeme
DNA sekveneerimine. DNA sekveneerimine- DNA nukleotiidse järjestuse kindlaks tegemine. Ensümaatilise meetodi puhul kasutatakse DNA-polümeraasi abil toimuva topeltahela sünteesi blokeerimist kindla nukleotiidi kohal. Tulemuseks on erineva pikkusega fragmendid, mille elektroforeesil joonistub välja DNA molekuli NH järjestus. Polümeraasi ahelreaktsioon. PCR viiakse läbi biokeemilise reaktsioonina ja selle puhul ei vajata elusorganisme DNA kopeerimiseks. Reaktsioon pôhineb ensüümi- DNA-polümeraas kasutamisel, mis katalüüsib DNA komplementaarse ahela sünteesi. PCR on DNA-molekuli paljundamine kunstlikes tingimustes. Reaktsiooni läbiviimiseks on vajalik teada uuritava DNA lôigu otste nukleotiidset järjestust. Reaktsiooni käivitamiseks kasutatakse kahte oligonukleotiidset (väiksest arvust nukleotiididest koosnevat- 8..30) praimerit (ingl. k. primer), mis kumbki vastavad ühe
Eksoensüümid: *proteaasid, hüaluronidaas, fibrinogeen, laminiin Eksotoksiinid: * streptolüsiin A, O, S. S. pyogenes kuulub kõige agressiivsemate patogeenide hulka nn „lihasööja bakter“. Pürogeenne eksotoksiin A osaleb streptokoki toksilise šoki sündroomi patogeneesis, tekib hüpotensiivne šokk, isheemial põhinev nekroos. * leukotsidaalne toksiin beetahemolüütilised streptokokid on patogeensemad kui alfa. 4. Str. Equi iseloomustus Nõlg on väga nakkav ülemiste hingamisteede infektsioon, mida põhjustab S. equi var. equi. Nakatuda võivad igas vanuses hobused, kuid nooremad on tundlikumad. Beetahemolüüs, väga kõrgelt nakkav infektsioon (ka saastunud sööt, allapanu, hooldusesemed). Moodustavad väga mukoidseid kolooniaid. Gram + liikumatu. 5. Str. Suis iseloomustus Gram +, ümar, fakultatiivne anaeroob ja katalaas -. Eristatakse 35 serovarianti (sagedasemad 2,3,4,8). Kuulub rühma D, seatööstuse nuhtlus. Põhjustab sigadel eri vanuses meningiiti,
lümfotsüüdid. Immunoglobuliinidel on omadus "ära tunda" ja seonduda antigeenidega. IMMUNOGEEN on antigeen, mis kutsub esile immunvastuse. Reeglina makromolekulid. Kõik immunogeenid on antigeenid, aga mitte alati vastupidi. Immunogeensus antigeenil sõltub molekuli suurusest, keemilistest omadustest jne. Nõrgad immunogeenid ei saa degradeerida ja esitleda T- rakkudele. Suur, lahustumatu makromolekul on parem immunogeen, kui väike. HAPTEEN on madalmolekulaarne aine, millel on epitoop e. antikeha seostumise koht, kuid mis ise ei kutsu esile immuunvastust. EPITOOP ehk antigeenne determinant on antigeeni osa, kuhu antikeha seondub. Immunogeensus - võime esile kutsuda spetsiifilise im.vastuse (humoraalsel või rakulisel tasandil). Antigeensus on võime spetsiifiliselt seonduda AK-de või TCR-iga KAASASÜNDINUD IMMUUNSUS moodustab esmase kaitseliini, kiire, kuid mitte tõhus: a. Anatoomiline i. Nahk patogeenivastane barjäär, happeline keskkond. ii
SISSEJUHATUS Toiduainetööstuste eesmärgiks ja ülesandeks on rahuldada tarbijate vajadusi. Toiduainete ostmisel eeldab tarbija, et saab täisväärtusliku, võltsimata ja ohutu toote. Seepärast ei tohi ükski toiduaine põhjustada sööja haigestumist ega vigastusi. Riknenud toote võib tarbija maitsmis- ja haistmismeele abil kindlaks teha, kuid haigusttekitavate mikroorganismidega saastunud toiduainet on võimatu teistest eristada. Nii võib saada maitsvast juustutükist hoopis listerioosi tekitaja. Vaatamata tarbijate ja toidukäitlejate teadlikkuse tõusule ning toiduainete tehnoloogiate kaasajastamisele ja täiustamisele ei ole toidust tingitud haigestumiste esinemis- sagedus siiski vähenenud. Igal aastal kannatavad inimesed toidust põhjustatud hai- guste all, mis tavaliselt esinevad tõsise kõhulahtisuse, oksendamise või kõhukram- pide näol saastunud või mürgiste toitude söömise või joomise tagajärjel. Toidust
DNA sekventeerimine DNA sekveneerimine- DNA nukleotiidse järjestuse kindlaks tegemine. Ensümaatilise meetodi puhul kasutatakse DNA-polümeraasi abil toimuva topeltahela sünteesi blokeerimist kindla nukleotiidi kohal. Tulemuseks on erineva pikkusega fragmendid, mille elektroforeesil joonistub välja DNA molekuli NH järjestus, need saab siis tuvastada. 42. Polümeraasi ahelreaktsioon PCR viiakse läbi biokeemilise reaktsioonina ja selle puhul ei vajata elusorganisme DNA kopeerimiseks. Reaktsioon pôhineb ensüümi- DNA-polümeraas kasutamisel, mis katalüüsib DNA komplementaarse ahela sünteesi. PCR on DNA-molekuli paljundamine kunstlikes tingimustes. Reaktsiooni läbiviimiseks on vajalik teada uuritava DNA lõigu otste nukleotiidset järjestust. Reaktsiooni käivitamiseks kasutatakse kahte oligonukleotiidset (väiksest arvust nukleotiididest koosnevat (8..30) praimerit (ingl. k. primer), mis kumbki vastavad ühe komplementaarse DNA
kuidas ja miks? EA polümorfismi kasutatakse loomade identifitseerimiseks ja pôlvnemise selgitamiseks. Eriti tôhus on see meetod liikidel, kellel on avastatud palju veregrupisüsteeme, kus on palju erinevaid alleele. See võimaldab kindlaks teha iga looma jaoks ainult temale omane veretüüp. Veregrupid - veregruppide eristamise aluseks on veres esinevad antigeenid ja antikehad. Veregruppide antigeenid on punalibledel, antikehad aga vereplasmas. Antigeen vallandab antikeha tekke võõrasse organismi sattumisel. Veregruppe saab määrata 2 testiga – hemolüüs ja aglutinatsioon Hemolüüsitest - kasutatakse seroloogilisi plaate veregruppide määramiseks. Kui täpp on augu põhjas – hemolüüsi ei toimunud ja antigeen puudub. Kui täppi pole, on toimunud hemolüüs (antigeen olemas). Veised, hobused. Verest erütrotsüüdid kätte. Kasutatakse lisaks komplementi. Aglutinatsioonitest - määratakse veregruppe. Segatakse kokku veri ja antikehadega reagent
kannavad ka T-lümfotsüüdid, mille pinnal on nakatatud rakke ära tundvad retseptorid. Veel üheks rakulise immuunsuse kandjaks on NK-rakud. T-lümfotsüüdid ja NK-rakud täiendavad üksteist: need nakatatud rakud, mis jäävad märkamatuks T-rakkude poolt, äratavad NK-rakkude tähelepanu, ja vastupidi. 6. Klonaalse selektsiooni hüpotees B-rakkude aktivatsioon ( T-rakud sama põhimõte); aktiveerimata rakud = naiivsed ja aktiveeritud =efektor- rakud. Antikeha sekretsioon ja samas ka mälurakkude teke Omandatud immunsuse põhimõiste, mis väidab, et omandatud immuunvastuse annavad iseseisvad antigeen-spetsiifilised lümfotsüüdid, mis on organismi enda suhtes tolerantsed. Seleteeritakse välja need rakud, mis ei reageeri organismi enese antigeenidega. Selektsiooni mitte läbinud lümfotsüüdid lähevad apoptoosi ja nad fagotsüteeritakse makrofaagide poolt. Positiivne selektsioon toimub tüünuse koores, negatiivne säsis
· Fikseeritud äigepreparaadi töötlus kristallvioleti (või gentsiaanvioleti) 1%-lise lahusega 1 minuti vältel · Pesemine veega, kasutades pesupudelit. · Töötlemine Lugoli lahusega 0.5 - 1 minuti jooksul. · Pesemine etanooliga 30 - 40 sekundi vältel. · Värvimine fuksiiniga 0.5 - 1 minuti vältel. Kasutatakse Pfeifferi fuksiini. · Loputamine veega. · Kuivatamine õhu käes · Mikroskopeerimine, kasutades immersioonobjektiivi. Sarcina Bakter 1 Bakter 2 E. coli 3) Iseloomustage ja põhjendage mikroorganismide kasvusõltuvust keskkonna happelisusest. Happe ja leeliselembeliste mikroorganismide nimesid. Äärmuslikult happelisi tingimusi eelistavaid mikroorganisme nimetatakse atsidofiilideks, leeliselembelisi alkalofiilideks. Iga bakteriliik varieerub oma kasvutingimuste optimumiga. Kuigi, enamus baktereid eelistab rohkem neutraalseid tingimusi. Atsifofiilid ei ole võimelised kasvama
pealt DNA-st), kus mõned DNA osad lõigatakse välja. Lõplik geen mille pealt antikehi toodetakse on lühem. Erinevates rakkudes on need erinevad ja seekaudu tekitatakse juhuslikult lõpmata palju antikehasid. (transkriptsiooni käigus) See tõestab, et on olemas rakke kus genoom ei ole samasugune. Antikehade kasutamine molekulaarbioloogias. Märgistatud antikehad seonduvad uuritava molekuliga (valguga) Saab teha kindlaks nende valkude sisalduse proovis. Saab panna ensüümi valgu antikeha külge ELISA värvime antikehi floresseeruvate molekulidega visualiseerimiseks hübridiseerid filtrit antikehadega western blotting Millised on monoklonaalsed antikehad? Monoklonaalne antikeha - antikeha, mis on produtseeritud ühe raku või rakuliini poolt, mis on ühest rakust arenenud. On identsed ja omavad unikaalset aminohappe järjestust, kasvavad identselt. Reageerivad vaid ühe epitoobiga antigeeni molekulis. Homogeenset
lõikesaite. Suurus varieerub 1-400 kbp. Identseid plasmiide võib olla 0-tuhandeid. Insenerigeneetikas nim plasmiide vektoriteks. 6. DNA kloonimise põhietapid isepaljunevas süsteemis. 1. plasmiid isoleeritakse bakterirakust (E. coli) 2. plasmiidi lõigatakse kindla restriktaasiga 3. sama restriktaasiga lõigatakse huvipakkuv DNA lôik kromosoomist välja 4. isoleeritud DNA lõik "istutatakse" plasmiidi 5. plasmiid viiakse bakterirakku, bakter kasvab ja plasmiid paljuneb 6. paljundatud geen isoleeritakse plasmiidist. 7. Milleks kasutatakse polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR), milliseid põhikomponente selleks vajatakse, millised on PCRi põhietapid? Kasutatakse uuritava DNA lõigu paljundamiseks in vitro.Geenide polümorfismi detekteerimine. Vajatakse: * kaks praimerit – peavad olema komplementaarsed uuritava DNA ahelate otstega * maatriks * termostabiilset Taq polümeraasi * vabu nukleotiide
restriktaasiga s.o geeni isoleerimine; 4) isoleeritud geeni "istutamine" plasmiidi 5) plasmiidi viimine bakterirakku ja bakteri kasvatamine, mille kaigus paljuneb ka vastav plasmiid. 6) paljundatud geeni isoleerimine plasmiididest. Teiseks DNA kloonimise voimaluseks on polumeraas-ahelreaktsiooni (PCR-polymerase chain reaction) kasutamine. PCR viiakse labi biokeemilise reaktsioonina ja selle puhul ei vajata elusorganisme DNA kopeerimiseks. Reaktsioon pohineb ensuumi DNA-polumeraas kasutamisel, mis kataluusib DNA komplementaarse ahela sunteesi. PCR on DNA-molekuli paljundamine kunstlikes tingimustes. Reaktsiooni labiviimiseks on vajalik teada uuritava DNA loigu otste nukleotiidset jarjestust. Reaktsiooni kaivitamiseks kasutatakse kahte oligonukleotiidset vaiksest arvust (8..30) nukleotiidist koosnevat praimerit (ingl. k. primer), mis kumbki vastavad uhe komplementaarse DNA ahela alguse nukleotiidsele jarjestusele ja talitlevad kui ensuumi
32. Viiruste ehitus Viirused on eluta ja elusa looduse piirimail olevad rakulise ehituseta ainult elusrakkudes paljunevad bioloogilised objektid. Viirus on rakuta moodustis, tema koostises on vähemalt: · genoom (nukleiinhape- DNA või RNA)- nikleiinhaped säilitavad pärilikku info.Viirusel peab olema vähemalt kolm geeni · kapsiid(valgud)- kaitseb genoomi keskkonnamõjutuste eest ja aitab viiruse genoomi peremeesrakku. Nendele võib lisanduda ümbris, mille viirus rakust väljudes kaasa võtab. St. viiruse ümbris koosneb rakumembraani koostisosadest: lipiitidest ja valkudest. Kapsiid ja ümbriis on genoomi kaitseks, aga ka viiruse rakku tungimise tagamiseks (taku äratundmiseks). Viiruse ümbrise pinnal on valgus, mis käituvad signaalidena. Kui raku membraani pinnal plevad valgud seonduvad viiruse valkudena, siis rakk arvab, et see on mingi signaal ja viirus viiakse raku sisse..Siis viirus alustab raku sees oma tegevust. 33. Viiruste paljunemine vt
ning kuna E. Coli rakke töödeldakse külmades tingimustes, toimub temperatuuri muutus (heat shock) ning selle tulemusena tekivad rakuseina kahjustused, kust plasmiidne DNA pääseb rakku. 51. Sini-valge selektsioon: järjestus on kodeeritud lacZ keskele ning lacZ kodeerib β- galaktosidaasi. Substraadi X-gal juuresolekul tekitavad bakterid elutegevuse käigus (β- galaktosidaas hüdrolüüsib glükosiidsideme ja tekivad galaktoos, mille bakter ära sööb, ning 5- bromo-4-kloro-3-hüdroksüindool, mis dimeriseerumise ja oksüdeerimise tagajärjel annab sinist värvi) sinist pigmenti – kolooniad on sinised. Valgete kolooniade puhul sisestatav järjestus rikub lacZ geeni ning muudab sealt kodeeritava ensüümi inaktiivseks, mille tõttu sisestatud DNA järjestusega plasmiide sisaldavad bakterikolooniad ei värvu siniseks. Meid aga huvitavad valged kolooniad. 1. Transformeerimiseks on vaja inaktiveerida ligaas
bakterile, määravad bakteriraku omadusi. Bakteri kromosoom on üldjuhul tsirkulaarne. Transformatsioon – doonori DNA molekul satub retsipientrakku väliskeskkonnast. Transduktsioon – bakteri DNA kandub ühest rakust teise bakteriofaagide abil. Konjugatsioon – bakteri DNA vahetu ülekanne doonorist retsipienti, mis eeldab rakkudevahelist kontakti. Peamisteks kanaliteks on F-rakud. 4. Bakteriofaagid e. bakteri viirused. Bakteriofaag - on bakteri viirus, mis võib kindlat liiki bakterit rünnata ja selle tappa (lüüsida). Bakteriofaagid, kes suudavad hävitada ühte bakteri liiki, on täiesti toimetud teiste bakterite suhtes. Igale bakterile vastab sama liiki bakteriofaag. Virulentsed – põhjustavad rakkude lüüsumise. Mõõdukad (tempereeritud) – säilivad bakteri genoomis „vaikivana“ ja aktveeruvad hiljem. 5. Kuidas jaotatakse prokarüootseid mikroorganisme meditsiinilises mikrobioloogias:
Kuna bakteritel puudub tuum on nad eeltuumsed e.prokarüoodid. Tuuma asemel on neil tuumapiirkond e.nukleoid. Bakteritel on ainult üks rõngakujuline kromosoom. Bakterirakk on kaetud kapsliga, mis kaitseb neid keskonna mõjude eest. Veel esineb bakterirakus DNA rõngasmolekul e. plasmiid. Bakterid paljunevad pooldudes.Vees elavatel bakteritel on gaasivakuoolid. Plasmiid on väike rõngas DNA. Selles on geenid, mis aitavad bakteril elada ekstreemsetes oludes. Ilma plasmiidita on bakter elujõuetu.Antibiootikumide suhtes võivad bakterid muututa resistentseks. Plasmiide võib olla mitu bakteril. Bakterirakk kooseneb: 1. Rakuseinast Bakteri väline kuju oleneb rakuseinast, mis kaitseb teda kahjulike välismõjude eest ja kindlustab bakterile suhteliselt püsiva kuju. 2. Plasmamembraanist Plasmamembraan paikneb tihedalt vastu tsütoplasmat ja rakuseina ning muutub hästi nähtavaks plasmolüüsi korral
preparaatide rühm toimemehhanism resistentsuse mehhanismid esindajad toimespekter β-laktaamsed • Antibiootikum seostub • β-laktamaaside produktsioon penitsilliinid naturaalsed kõik streptokokid, meningkokid, enamik G+ antibioootikumid penitsilliini siduva proteiiniga nii G- kui G+ mikroobidel anaeroobe. minimaalne aktiivsus stafülokokkide (bakteritsiidsed) (PBP) (plasmiidne DNA, G- suhtes • Peptidoglükaani süntees
Kordamisküsimused Geenitehnoloogia I 1. Millised molekulid on polümeerid? Polümeerid on väga suured molekulid, mis koosnevad tuhandetest väiksematest omavahel ühendatud molekulidest ehk monomeeridest. DNA, puit ja valk on kõik polümeerid http://miksike.ee/docs/referaadid2005/polumeerid_evelin.htm 2. Nukleotiidide lühiiseloomustus. Nukleiinhappe monomeer, mis on moodustunud lämmastikaluse, 5 süsinikulise suhkru (riboosi või desoksüriboosi) ja fosfaatrühma liitumisel. 3. Nukleiinhapete lühiiseloomustus. Biopolümeerid, mille monomeerideks on nukleotiidid. Nukleiinhappeid on kahte tüüpi: ·Deoksüribonukleiinhape (DNA) - leidub raku tuumas, mitokondris ja kloroplastis ·Ribonukleiinhape (RNA) - leidub kogu rakus Nukleiinhapped on polünukleotiidid. Iga nukleotiid koosneb kolmest osast: Fosfaatgrupp, 5-süsinikuline suhkur ehk pentoos (DNA-s on selleks 2- desoksüriboos; RNA-s riboos), lämmastikalus 4. Mida tähendab komplement
ja tema asukoht elektroforegrammil on vôimalik kindlaks määrata, kuna sond on märgistatud. Northern blotting'iks nimetatakse RNA fragmentide määramist samal meetodil. 51. Antikehade kasutamine molekulaarbioloogias Antikehad on immuunsüsteemi efektiivsed tööriistad kahjustavate haigustekitajate ja võõrühendite spetsiifiliste struktuuride äratundmisel ja eemaldamisel 1) ANTIGEENIDE KINDLAKSTEGEMINE 2) MEDITSIINILINE JA VETERINAARNE DIAGNOSTIKA 52. Mis on roheline fluorestseeruv valk, milleks ja kuidas seda kasutatakse? Kumab rohelist sinise kuni UV valguse käes Sellega saab “värvida” [valke või DNA-sid või rakke], mikroskoobis neid vaadelda Nagu markerid 53. Kuidas konstrueerida üht transgeenset looma? 1. Võetakse looma viljastatud munarakk, sisestatakse vajalikke geene ning embrüo viiakse surrogaatemasse 2
annaabi.ee 
Sisene Facebook'ga
Sisene Google'ga
Sisene LinkedIn'ga
