Tallinna Tehnikaülikool 3.1 Invertaasi aktiivsuse määramine Biokeemia labori protokoll 2011 Töö teoreetilised alused Invertaas ehk -D-fruktofuranosiidi fruktohüdrolaas on ensüüm, mis kuulub glükosiidsideme hüdrolaaside hulka, mis katalüsivad O-glükosiidsidemete hüdrolüüsi. Invertaas katalüüsib -D-fruktofuranosiidide hüdrolüüsireaktsiooni, vabastades neist fruktoosi molekule: -D- fruktofuranosiid + H2O ,D-fruktoos + mono- või oligosahhariid
TALLINNA TEHNIKAÜLIKOOL Keemia instituut Bioorgaanilise keemia õppetool Biokeemia praktikumi laboratoorne töö 3.2 Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine Üliõpilane: Liis Hendrikson Matrikli nr: 104191 Õpperühm: KATB 41 Juhendaja: Tiina Randla 3.2 PROTEOLÜÜTILISE ENSÜÜMI AKTIIVSUSE MÄÄRAMINE Töö teoreetilised alused: Proteolüütilised ensüümid ehk proteaasid (ka proteinaasid või peptidaasid) on ensüümis, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi reaktsiooni valkudes ja peptiidides, produtseerides madalama molekulmassiga peptiide ja vabu aminohappeid. Proteaase leidub
Tallinna Tehnikaülikool Biokeemia Laboratoorne töö 3.2 Teostaja: 2016 3.2 Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine Proteolüütilised ensüümid ehk proteaasid, on ensüümid, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi reaktsiooni valkudes ja peptiidides, produtseerides madalama molekulmassiga peptiide ja vabu aminohappeid. Proteaase leidub kõikides organismides, nad seedivad näiteks toiduvalke. Erinevad proteaasid omavad ka erinevat toimespetsiifikat. Mõned proteolüütilised ensüümid lõhustavad vaid teatud aminohapetega külgnevaid peptiidsidemeid (piiratud proteolüüs).
trüpsiin, kümotrüpsiin, pepsiin, alkalaas, subtilisiin, savinaas) EKSOPEPTIDAAS ensüüm, mis toimib polüpeptiidahele otsmistele peptiidsidemetele. Nad lühendavad peptiide, vabastades ühekaupa C- või N-terminaalseid aminohappeid (nt karboksüpeptidaasid R2=C-terminaalne aminohape ja aminopeptidaasid R1=N-terminaalne aminohape) Ensüümi toimimiseks optimaale pH väärtuse järgi eristatakse järgmisi ensüüme: 1. HAPU PROTEAAS ensüüm, mis toimib, kui pH2,5 2. NEUTRAALNE PROTEAAS ensüüm, mis toimib, kui pH7,2 3. LEELISPROTEAAS ensüüm, mis toimib, kui pH9,0 Aktiivtsentri ehitus ja sellest tulenev ensüümi toimemehhanism on oluliseks proteaaside klassifikatsiooni aspektiks. Selle põhjal saab välja tuua neli peamist rühma: 1) Seriinproteinaasid 2) Tioolproteinaasid 3) Aspartaatproteinaasid 4) Metallproteinaasid Hüdrolüüsunud peptiidsidemete hulk ei ole otseselt mõõdetav, mistõttu avaldatakse
03 0.02 0.01 0 0 320 620 915 Proovi aeg t (s) Arvutan ensüümipreparaadi proteolüütilise aktiivsuse A vastavalt valemile: ΔC Tyr × 103 × V 1 × V 2 × 2 ( 0,072−0,039 ) ×103 ×26 ×5 × 2 A= Δt × 181×V 3 × g = 915 ×181 ×1 ×0,0208 = 2,49 μkat/g ΔCTyr – türosiini kontsentratsiooni muutus valitud ajavahemikus (mg/mL) Δt – hüdrolüüsi kestus st valitud ajavahemik (s) V1 – reaktsioonisegu (substraat + ensüüm) üldmaht (ml) V2 – valmistatud ensüümilahuse üldmaht (ml) 2 – TKÄ lahusest tingitud proovi lahjendus V3 – ensüümi maht hüdrolüüsisegus (ml)
loksutan reaktsioonisegu läbi ja fikseerin reaktsiooni alguse aeg. Võimalikult kiiresti võtan puhta kuiva pipetiga 3 ml reaktsioonisegu, viin esimesse TKÄ-d sisaldavasse katseklaasi (0- proov) ja loksutan hoolega. Peale proovi võtmist asetan reaktsiooniseguga katseklaas tagasi termostaati. Täpselt 5 minuti pärast võtan saa pipetiga 3 ml reaktsioonisegu teise katseklaasi ja klaasi sisu loksutan hoolega läbi. Sama operatsiooni kordan veel 2 korda, s.t. ensüümireaktsiooni 10-ndal ja 15-ndal minutil. Reaktsiooniproduktide sisalduse määramine ja aktiivsuse arvutamine Proovidega katseklaasit jätan 15 minutiks sademe formeerumiseks. Sel ajal panen valmis 4 puhast ja kuiva katseklaasi ning varustan neid väikeste plastlehtrite ning paberfiltritega. 15 minuti pärast filtrin kuivadesse katseklaasidesse. Saadud filtraadid on täiesti selged. Spektrofotomeetril määran nelja, erineval ajal reaktsioonisegust võetud proovi optilise
arvesse,sest see ei ole täpne ja tõenäoline.Selline tulemus tuli välja,sest katseklaasi oli valatud liiga suur või liiga väike kogus reaktsioonisegu,või pärast kolmanda proovi võttmist on möödunud vähe aega.) Türosiini kontsentratsioon graafiku alusel (mg/ml): 1) 0,028 mg/ml 2) 0,032 mg/ml 3) 0,035 mg/ml 4) 0,037 mg/ml( ei võtta arvesse) Graafik: Ensüümipreparaadi proteolüütilise aktiivsuse arvutamine A = CTyr · 103 · V1 · V2 · 2 / t · 181 · V3 · g CTyr türosiini kontsentratsiooni muutus valitud ajavahemikus (mg/ml), t hüdrolüüsi kestus st valitud ajavahemik (s), V1 reaktsioonisegu (substraat + ensüüm) üldmaht (ml), V2 valmistatud ensüümilahuse üldmaht (ml), 2 TKÄ lahusest tingitud proovi lahjendus (3 ml 6 ml, seega L = 2), V3 ensüümi maht hüdrolüüsisegus (ml), g proteaasi preparaadi kaalutis (g), 181 türosiini molekulmass.
Δt – hüdrolüüsi kestus st valitud ajavahemik (s), Δt = 904 sek V1 – reaktsioonisegu (substraat + ensüüm) üldmaht (ml), V1 = 26 ml V2 – valmistatud ensüümilahuse üldmaht (ml), V2 = 5 ml 2 – TKÄ lahusest tingitud proovi lahjendus (3 ml → 6 ml, seega L = 2), V3 – ensüümi maht hüdrolüüsisegus (ml), V3 = 1 ml g – proteaasi preparaadi kaalutis (g), g = 17,9 mg=0,0179g ∆ C Tyr ∙103 ∙V 1 ∙ V 2 ∙ 2 0,134 ∙ 103 ∙ 26 ∙ 5∙ 2 μkat A= = =11,89 ∆ t ∙ 181∙ V 3 ∙ g 904 ∙181 ∙1 ∙ 0,0179 g Järeldus μkat Alkalaasi proteolüütiline aktiivsus on 11,89 g , mis tähendab, et 30 kraadi juures 1 sekundi jooksul vabastab ensüüm 11,89 μ mol aminohapet. Katse ebatäpsus võis tuleneda ebatäpse aja
Kõik kommentaarid