Molekulaardiagnostika (1)

KORDAMISKÜSIMUSED
Talpsep 1. Millisel juhul on LCR eelistatud meetod PCR ­ga võrreldes LCR on suurema spetsiifilisusega kui PCR. Seda on kaval kasutada tuntud järjestuste ja punktmutatsioonide tuvastamiseks kui kasutada oleva DNA kogus on limiteeritud.
2. Milline meetod võimaldab RNA amplifitseerimist DNA juuresolekul? NASBA on RNA tuvastamiseks eriti hea meetod: RNA ahelale saab panna pöördtranskriptaasiga praimeri juurde, sünteesitakse uus ahel, RNAas lõhutakse H-ga ära ja sünteesitakse uuesti jne kuni saadakse detekteeritav kogus nukleiinhappe molekule. Tal on ka see omadus, et töötab DNA juuresolekul ­ ei pea proovi ära puhastama, mis RNA puhul on väga keeruline. Kasutatakse ka ekspressiooniproduktide määramiseks.
3. Millised ensüümid on vajalikud TMA meetodil amplifitseerimiseks? TMA- transcription mediated amplification.
RNA polümeraas ja pöördtranskriptaas
4. Milliste nakkushaiguste diagnoosimisel on nukleiinhappe amplifitseerimise meetodid asendamatud? Bakteriaalsete: kuna ribosoomide järjestused on erinevate bakterite liikide korral erinevad, saab rRNA järjestuse põhjal liike määrata. Kui mikrokannukeses olevas uuritavas proovis on RNA molekul olemas, siis ta spiraliseerub kaksikheeliksiks, mille tunnevad ära värvusreaktsiooni katalüüsivate ensüümidega märgistatud antikehad . Meetodi piiranguks on RNA molekulide piiratud arv (10 000) rakus ­ sellepärast amplifitseeritaksegi RNA hulk PCRil (tekib miljardeid koopjaid). [Seda meetodit nimetatakse GenProbe meetodiks]
5. Mis limiteerib GenProbe meetodi (hübridiseerimine) puhul testi tundlikkuse?
Nukleiinhapete hübridiseerimine: amplifitseerimise korral nimetatakse oligonukleotiidi praimeriks, hübridiseerimisel sondiks. Ahelad keeratakse lahti ja kui on sondile komplementaarne järjestus, siis renaturatsiooni puhul see lühike sond seondub eelistatult DNA ahelaga, sest alati lühike nukleotiidi järjestus seondub pika ahelaga paremini kui kaks pikka ahelat omavahel.
INNO-LIPA hübriidimise meetod: amplifitseeritakse DNA, kasutades biotiin -märget (biotinoleeritud nukleotiidid ), mis seob streptavidiini ­ tekkiv kompleks on üks tugevamaid bioloogilisi interaktsioone. Streptavidiini küljes on veel fosfataas värvireaktsiooni läbi viimiseks . Peale amplifikatsiooni viiakse see kõik testribale, kus iga triip vastab ühele järjestusele. Hübridisatsiooni korral tekib värvireaktsioon.
*Sondi pikkus (mida lühem sond, seda suurem võimalus leida temale vastavaid sama lühikesi järjestusi erineva järjestusega pikemate järjestuste seast). *Nukleiinhape puhtus *Nukleiinhappe kogus *
6. Kuidas tuleks korraldada seroloogilist testimist kui antud nakkuse puhul on seropositiivsus laialt levinud nähtus? Otsida organismist antigeeni, mitte vastust sellele. · Vähemalt kaks järjestikust teist (10 ­ 14 päevase vahega) tuleb teha · Arvestada, et reinfektsioonil IgM tiiter ei tõuse · ja teisi ebamugavusi
7. Loetle PCR eelised. Kiire (analüüsi aeg 2 - 12h) tundlik (avastab 2 ­ 10 patogeeni rakku proovist) tootlik (võimaldab määrata mitu patogeeni ühest proovist) vähenõudlik (transpordi- ja säilitustingimuste suhtes) täpne (tuvastab patogeeni olemasolu, mitte organismi reaktsiooni sellele) lisavõimalused (genotüpeerimine, sekveneerimine ) 8. Loetle PCR puudused mittekvantitatiivne (tavaline PCR puhul) saastamisoht (võib anda valepositiivse tulemuse) ei tuvasta resistentsust antibiootikumidele ei tee vahet elusal ja surnud mikroobil hind (aparatuur, labor , patent) 9. Millised on PCR-diagnostikalabori organisatsiooni põhiprintsiibid? 1. 1. ruumis eraldatakse proovist DNA. See on bioohu ruum, sest töötajad võivad sealt ise nakkuse saada. Ruumid eraldi negatiivse rõhu all, sisse- ja väljaminev õhk filtreeritakse; töötajad hepatiidi vastu vaktsineeritud. 2. Puhas ruum, kus tehakse PCRi stock lahused. 3. Proovide kokku segamise ruum 4. amplifitseerimise ruum termoblokkidega 5. detekteerimise ruum, kus dokumenteeritakse ka tulemused. 6. Mitte ükski asi ei liigu ruume mööda vastupidises suunas. Kõige selle kontrollimiseks on kvaliteedi kontrollimise ja tagamise süsteem (räme bürokraatia) ­ külmkapi näidud käsistsi hommikul ja õhtul üles kirjutada; pipetid regulaarselt kalibreerimisel; jne. Oma arendusosakond peab in house laborites juures olema, et kontrollida ja arendada. Viimasele on alternatiivid robotite ja kitide kasutamine või kommertsiaalsete kitide kasutamine. Kvaliteedikontrollile alternatiive pole. 1. Valideerimise üks osa on laboritevahelised võrdluskatsed, mida viib läbi organisatsioon QCMD.
10. Millised ja millal tehtud avastused olid eelduseks molekulaardiagnostika meetodite väljaarendamisele ? (Nimetage mõned teie arvates olulisemad) 1869 ­ DNA avastamine 1953 ­ kaksikheeliks 1969/70 ­ ensüümid restriktaasid PCR 1989 ­ Taq polümeraas kaksikheeliksite de- ja renaturatsioon nukleotiidide komplementaarsus 11. Milliseid molekulaardiagnostika meetodeid kasutatakse Eestis nakkushaiguste diagnoosimisel? Hübriidimine (sh FISH ) PCR sekveneerimine mikrokiip -analüüs
12. Milliseid meetodeid kasutatakse patogeensete mikroorganismide tuvastamiseks ( mikroskoopia , isoleerimine ja kultiveerimine, biotestid, immunotestid s.o antigeeni määramine ja antikehade määramine, biokeemilised testid, molekulaarbioloogilised testid) ? Erinevate meetodite plussid ja miinused.
Meetodid: 1. mikroskoopia ­ vanim, väga kiire, odav. Paljude patogeenide puhul annab väga hea tulemuse. Valgusmikroskoobid on odavad. Puudused: eeldab väga hea mikroskoopia kogemust; pole väga tundlik meetod; sõltub transpordist; 2. isoleerimine/kultuurimeetod ­ plussiks on spetsiifilisus. Miinused: mikroob ei tohi transpordi käigus enne kultuuri panemist ära surra; võib siiski osutuda mittespetsiifiliseks (söötmetest sõltuv); aeganõudev (tuberkuloosibakter kasvab 1,5 ­ 2 kuud); nõuab samastamist (kasvatame üles, peame veel kinnitama , et on see bakter ­ DNA hübridisatsiooniga); inimest on juba ravima hakatud ja alles siis võetakse proov ­ kasv on pärsitud juba; saastamine transpordil. 3. Biotestid 1. rakukultuur ­ kliiniline proov, millega neid rakke nakatame. Kõige tuntum on klamüüdia diagnostika . Rakukultuuris kasvatatud organism ei tohi olla transpordil või ravi tõttu surnud. 2. Loomkatsed ­ katkupisiku diagnostika. Eetikaküsimus. Loomad on väga kallid. Loomakaitsjad võitlevad selle vastu. 4. Kiirmeetodid (molekulaardiagnostika) 1. nukleiinhapete määramine 2. antigeeni/ antikeha määramine ­ antigeen ja antikeha peavad omavahel väga hästi sobima (steeriliselt ja laenguliselt), kui ainult laengud sobivad, tekib palju valepositiivseid tulemusi. Seroloogilised testid taluvad suht hästi transporti. Palju võimalik osta valmisteste. Suht kiire meetod. Määratakse antigeeni olemasolu veres e organismi vastureaktsioon, aga mitte patogeeni olemasolu veres ­ paljude haiguste puhul jäävad antikehad eluks ajaks püsima ja nii saab seropositiivse tulemuse ja võib ravima hakata kui tegelt vaja pole. Segavad immunkompleksid; ristreaktsioonid; midagi ei saa teada rakulise immuunvastuse kohta. Nakkushaiguste puhul on rusikareegele, et rakuväliste patogeenide puhul tulevad antikehad ja rakusisese ( viirus ) puhul rakuline immuunvastus. Vastuseid on sageli väga raske interpreteerida: selleks, et näha antikehade teket, on vaja kirjeldada nende tekke dünaamikat kahe järjestikuse prooviga (võetakse nt nädalase vahega), mis analüüsitakse korraga. IgM antikeha tekkimisel on alguses kõik viis erinevat raske ahela tüüpi. Pärastpoole lülitatakse ümber teistele antikehatüüpidele. Vastus on alati polükloonne e palju eri antikehi tekib sama epitoobi vastu. Kui nakkus pikka aega püsib, valitakse kõik paremad ja aktiivsemad antikehad välja. Seda afiinsuse olulist muutust tihti laborites ei arvestata. Seroloogilist meetodit soovitatakse rangelt kasutada ainult teadusuuringutes, mitte kliinilistes! 3. proteoomika meetodid 4. PCR ­ suht kiire vastus, ülitundlik (isegi natuke liiga tundlik), väga tootlik, väga vähenõudlik transpordi- ja säilitustingimuste suhtes, väga täpne (tuvastab patogeeni olemasolu), annab palju muid võimalusi (genotüpiseerimine nt). Puudused: 1. DNA kontaminatsioonioht. 2. Mittekvantitatiivne (võib anda valepositiivse tulemuse) 3. ei tuvasta resistentsust antibiootikumidele 4. ei tee vahet elusal ja surnud mikroobil ­ seda ei võeta enam väga tõsiselt, sest enamus surnud mikroobse viiakse organismist välja 2 ­ 3 päevaga. 5. Kallis ­ kas kasutada ise välja (in house) töötatud või kommertsiaalset meetodit. Kommertsiaalsed on kallid, väga paljude patogeenide jaoks ei ole neid kite üldse olemas. In house meetodeid saab suht kiiresti välja töötada patogeenidele vastavalt. PCRi tuleks eelistada siis, kui traditsiooniline meetod ei tööta: 1. mikroskoopia annab valepositiivse vastuse 2. rakusisese parasiidi puhul 3. kui tundlikkus on liiga madal 4. kui on vaja genotüpeerida ­ mis tüübiga on tegu (HCV, HSV) 5. kui mikroobi kasv on aeglane ( tuberkuloos )
13. Millest tulevad vead immunoloogiliste meetodite kasutamisel nakkushaiguste diagnoosimisel? Milliseid vigu ja kuidas saab vältida? Inimestel, kes korra Chlamydia pneumoniae'ga kokku puutuvad, jääbki antikehade tiiter verre igaveseks ­ seropositiivsus. Sellepärast on immunoloogilised (nt ELISA ) testid siinkohal täiesti kasutuskõlbmatud.
antigeeni/antikeha määramine ­ antigeen ja antikeha peavad omavahel väga hästi sobima (steeriliselt ja laenguliselt), kui ainult laengud sobivad, tekib palju valepositiivseid tulemusi. Seroloogilised testid taluvad suht hästi transporti. Palju võimalik osta valmisteste. Suht kiire meetod. Määratakse antigeeni olemasolu veres e organismi vastureaktsioon, aga mitte patogeeni olemasolu veres ­ paljude haiguste puhul jäävad antikehad eluks ajaks püsima ja nii saab seropositiivse tulemuse ja võib ravima hakata kui tegelt vaja pole. Segavad immunkompleksid; ristreaktsioonid; midagi ei saa teada rakulise immuunvastuse kohta. Nakkushaiguste puhul on rusikareegele, et rakuväliste patogeenide puhul tulevad antikehad ja rakusisese (viirus) puhul rakuline immuunvastus. Vastuseid on sageli väga raske interpreteerida: selleks, et näha antikehade teket, on vaja kirjeldada nende tekke dünaamikat kahe järjestikuse prooviga (võetakse nt nädalase vahega), mis analüüsitakse korraga. IgM antikeha tekkimisel on alguses kõik viis erinevat raske ahela tüüpi. Pärastpoole lülitatakse ümber teistele antikehatüüpidele. Vastus on alati polükloone e palju eri antikehi tekib sama epitoobi vastu. Kui nakkus pikka aega püsib, valitakse kõik paremad ja aktiivsemad antikehad välja. Seda afiinsuse olulist muutust tihti laborites ei arvestata. Seroloogilist meetodit soovitatakse rangelt kasutada ainult teadusuuringutes, mitte kliinilistes! 14. Mis on meetodi tundlikkus? Näitab valenegatiivse vastuse saamise ehk haigustekitaja ülesleidmise tõenäosust (%). 15. Mis on meetodi spetsiifilisus? Näitab valepositiivse vastuse saamise ehk ülediagnoosimise tõenäosust (%). 16. Milline on lihtne arvutusvalem tundlikkuse ja spetsiifilisuse määramiseks? Milliste ühikutega neid näitajaid esitatakse? Tundlikkus=positiivsed proovid /kõik proovid x 100% Spetsiifilisus=negatiivsed proovid/kõik proovid x 100% Mida suurem %, seda täpsem analüüs. 17. Võrdle kommertsiaalse kitil (testkomplektil) baseeruva PCR ja in house (home- brew ) diagnostikameetodeid. Millised on kummagi eelised ja puudused? In-house eelised: odavam, väga tundlik, väga kvaliteetne , uute avastuste kiire rakendamine, kliendisõbralik puudused: tulemuste kõikuvus Kommertsiaalne eelised puudused
18. Klamüdioosi, mükoplasmoosi ja ureaplasmoosi diagnoosimise päevaprobleemid (miks diagnoosida, kas diagnoosida, milliste meetoditega, millised on diagnoosimata jäänud nakkuse tagajärjed?).
Chlamydia trachomatis on Euroopas kõige levinum suguhaigus. Aasias avastati laste silma kasvajatest. Naised on 80% asümptomaatilised, aga viga on selles, et ta tekitab väga palju raseduspatoloogiat, enneaegset sünnitust (2 ­ 3 x tihemini) ja sigimatust. Vaginaalse sünnituse kaudu saab laps ka nakkuse, reeglina hingamisteedesse. Diagnoosimine: · Koekultuur ­ spetsiifilisus 100%, aga tundlikkus väga varieeruv (40 ­ 85%); pole enam kuldne standard. · immunofluorestsents ­ tundlikkus väga varieeruv (50 ­ 90%); eeldab kogenud eksperdi kaasamist. · EIA ­ spetsiifilisus hea (93 ­ 99%), aga tundlikkus väga väike ja varieeruv (20 ­ 85%); nõuab täiendavaid uuringuid . · GenProbe ­ spetsiifilisus hea, tundlikkus parem kui eelmistel (70 ­ 85%), aga ikkagi liiga madal. · PCR ­ spetsiifilisus hea (97 ­ 100%), tundlikkus varieeruv, aga siiski parim (70 ­ 95%); DNA kontaminatsioonioht. WHO soovitab kasutada meetodit, mitte tundlikkus on >90% ja spetsiifilisus >99%, seega sobib kasutamiseks ainult PCR.
Ureaplasma parvum on normaalne mikrofloora osa inimesel. Raseduse ajal on ta väga ohtlik, põhjustab katkemist.
Chlamydia pneumoniae tekitab pärgarteri skleroosi (veresoonte lupjumist), tagajärjeks südamerabandus. Ta petab immuunsüsteemi ära: 1. blokeerib fagosoomi 2. varjub latentsesse olekusse (kaetult organismi oma epitoopidega) 3. produtseerib antiapoptootilisi valke (viirustele omane) Inimestel, kes korra CP-ga kokku puutuvad, jääbki antikehade tiiter verre igaveseks ­ seropositiivsus. Sellepärast on immunoloogilised (nt ELISA) testid siinkohal täiesti kasutuskõlbmatud. · Pole kultuuris detekteeritav